超临界萃取法提取传统香药中的挥发油的醒脑提神香薰产品制备工艺的建立和质量标准研究

初洪波，刘 聪，刘艳华，成光宇*

（1.长春中医药大学附属医院，长春 130021；2.长春中医药大学，长春 130117）

本研究采用CO2超临界流体萃取技术提取传统中药薄荷、陈皮、辛夷和人参花中的挥发油类成分制成醒脑提神1 号香薰产品[1-4]。

1 材料与仪器

粉碎设备：高速中药粉碎机（HX-400A，浙江永康溪岸）；超声设备：超声波清洗器（KH-250D，江苏昆山禾创）；萃取设备：（HA-221-50-05-C，南通华安超临界萃取有限公司）；称量仪器：电子分析天平（CP225D，德国赛多利斯）；薄层色谱成像系统:瑞士CAMAG 公司。试剂、对照品和对照药材：试剂均为分析纯；陈皮对照药材，批号：120969-201806、辛夷（望春花）对照药材，批号：121079-201710。供试样品：醒脑提神1 号（批号：20200601）、样品2（批号：20200602）、样品3（批号：20200603）。

2 制备工艺

2.1 醒脑提神香薰1 号的制备工艺 称取过10 目筛的药材粉末100 g（重量比为薄荷:陈皮:辛夷:人参花=1:1:1:1），置于萃取釜内进行超临界萃取。通过单因素考察及正交试验选择最佳萃取条件[5-8]。采用走珠瓶的形式，通过提神强弱、提神持久性、香味好感度、透明度进行感官判断，确定了配方比例。

2.1.1 单因素的考察

2.1.1.1 萃取压力 萃取温度50℃，流量为20 L/h，时间为2 h。称取药材6 份，每份100 g（重量比为薄荷:陈皮:辛夷:人参花=1:1:1:1），粉碎过10 目筛。第1次为15 MPa，2 至5 次每次增加5 MPa 测定测定挥发油重量，第6 次为40 MPa，计算每次挥发油得率。萃取压力对挥发油得率影响的结果见图1。

图1 萃取压力对挥发油得率的影响

选择30 MPa 为最佳萃取压力，分析其原因：CO2超临界流体萃取时，由于压力的上升使CO2密度增大，萃取效率提高，故在15 MPa 至30 MPa 的区间，挥发油得率呈上升趋势。但当压力超过30 MPa 以后，CO2流体密度就一步增大，使其扩散减小，进而减少CO2流体与药材之间的接触，故在30 MPa至40 MPa的区间，挥发油得率呈下降趋势。

2.1.1.2 萃取温度（萃取压力30 MPa，流量为20 L/h，萃取时间为2 h）称取药材6 份，每份100 g（薄荷:陈皮:辛夷:人参花重量比为=1:1:1:1），粉碎过10目筛。第1 次为40℃，2 至5 次每次增加5 ℃测定测定挥发油重量，第6 次为65 ℃，计算每次挥发油得率。萃取温度对挥发油得率影响的结果见图2。

图2 萃取温度对挥发油得率的影响

选择55℃为最佳萃取温度，分析其原因：CO2超临界流体萃取时，由于温度的上升使CO2超临界流体粘度下降，扩散增大，萃取效率提高，故在 40 ℃至55 ℃的区间，挥发油得率呈上升趋势。但当温度超过55 ℃以后，CO2流体密度进一步降低，导致对挥发油的溶解度降低，故在55 ℃至65 ℃的区间，挥发油得率呈下降趋势。

2.1.1.3 萃取时间 萃取压力30 MPa，流量为20 L/h，萃取温度为50 ℃。称取药材6 份，每份100 g（重量比为薄荷:陈皮:辛夷:人参花=1:1:1:1），粉碎过20 目筛。第1 次为1 h，2 至5 次每次增加0.5 h 测定测定挥发油重量，第6 次为3.5 h，计算每次挥发油得率。萃取时间对挥发油得率影响的结果见图3。

图3 萃取时间对挥发油得率的影响

选择2.5 h 为最佳萃取时间，分析其原因：在流量恒定时，CO2超临界流体萃取时，随着萃取时间的延长，产率也相应的增大，故在1 h 至2.5 h 的区间，挥发油得率呈上升趋势。但当时间超过2.5 h 以后，醒脑提神方中的挥发油基本萃取完全，所以挥发油得率变化不显著。

2.1.2 正交试验 在单因素考察的基础上，需要进行正交试验，按L9（34）设计试验，进一步考察在压力、温度、时间的作用下，对挥发油得率的影响。（表1、表2、表3 分别是因素水平设计和结果）

表1 正交试验因素水平表

表2 CO2 超临界流体萃取挥发油正交试验直观分析结果

表3 CO2 超临界流体萃取油正交试验方差分析结果

从表2（直观分析）的结果，确定工艺中的萃取压力、萃取温度和萃取时间分别为30 Mpa、60 ℃和2.5 h，即A2B3C2。

从表3（方差分析）的结果可知，影响因素的主次关系依次为萃取压力（因素A）、萃取温度（因素B、萃取时间（因素C），萃取时间（因素B）没有显著性影响。从节约能源出发，确定工艺的萃取压力、萃取温度和萃取时间分别为30 Mpa、60 ℃和2 h，即A2B3C1。

综合表2 和表3 的结果，确定醒脑提神方中挥发油提取工艺条件的萃取压力、萃取温度和萃取时间分别为30 Mpa、60 ℃和2 h。

2.1.3 验证试验 取过10目筛的醒脑提神方药粉100 g，共3 份，按确定的工艺条件，测定挥发油得率。（结果见表4）。

表4 验证试验结果

挥发油的平均得率为3.87%，RSD 为1.55，证明了工艺条件的合理性和稳定性。

3 醒脑提神1 号的制剂成形性研究

3.1 剂型的选定 醒脑提神1 号香薰产品采用走珠瓶的形式，具有结构简单，携带和使用方便，涂抹均匀，并能通过走珠配合穴位按摩，兼具通鼻清凉和提神醒脑的作用。

3.2 原料的配比 为了更好地吸收和增加清凉感，醒脑提神1 号香薰产品还加入了适量的冰片和乙醇。同时纯的植物精油不能直接用于皮肤表面，又加入了抗氧化强的葡萄籽油作为基础油来稀释超临界提取的复方精油。从提神强弱、提神持久性、香味好感度、透明度等4 个方面进行复方精油的感官判断，确定CO2超临界流体萃取的复方精油配方比例为：0.5%冰片乙醇溶液:超临界提取挥发油:葡萄籽油=1:2:20[9-11]。

4 鉴别方法

4.1 陈皮的薄层鉴别 供试品溶液制备 取醒脑提神1 号内容液20 mL，置250 mL 圆底烧瓶中，加水150 mL，连接挥发油测定器，测定器上端加水（充满刻度并溢流入烧瓶），加乙酸乙酯2 mL 至测定器，连接回流冷凝管，加热回流2 h，分取乙酸乙酯层。对照药材溶液制备：取陈皮对照药材1 g，加乙醚10 mL，超声处理10 min，滤过，挥干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解。阴性对照溶液制备：先根据处方称取药材，制成不含陈皮的阴性对照样品，然后根据供试品溶液的制备方法制成。点样量：吸取上述三种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上。展开剂：正己烷-醋酸乙酯（9:1）为展开剂。显色方式：置紫外光灯（365 nm）下检视。层析结果见图4。

图4 陈皮薄层鉴别

4.2 辛夷的薄层鉴别 供试品溶液制备 取醒脑提神1号20 mL，置250 mL 圆底烧瓶中，加水150 mL，连接挥发油测定器，测定器上端加水（充满刻度并溢流入烧瓶），加乙酸乙酯2 mL 至测定器，连接回流冷凝管，加热回流2 h，分取乙酸乙酯层。对照药材溶液制备：取辛夷对照药材1 g，加乙醚10 mL，超声处理10 min，滤过，挥干，残渣加环己烷1 mL 使溶解。阴性对照溶液制备：先根据处方称取药材，制成不含辛夷的阴性对照样品，然后根据供试品溶液的制备方法制成。点样量：吸取上述三种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶GF254 薄层板上。展开剂：环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（11:2:0.2）。显色方式：置紫外光灯（254 nm）下检视。层析结果见图5。

图5 辛夷薄层鉴别

5 小结

醒脑提神1 号香薰产品确定了最佳的超临界萃取工艺，香薰产品包装采用走珠瓶，其结构简单，携带使用方便，涂抹均匀并能穴位按摩，具有通鼻清凉和提神醒脑的作用。代表性药材的薄层色谱鉴别专属性及重现性良好。所制得的醒脑提神1 号香薰产品气味清新，配比天然，提神醒脑效果好[12-16]。