冬凌草甲素与奥沙利铂联合应用抑制结肠癌肝转移的实验研究

杨 鹏，赵美兰，杨宇慎，赵雪峰

（大连大学附属新华医院，辽宁 大连 116021）

肝转移是结直肠癌死亡相关最主要的原因，其主要治疗方案为辅助化疗联合靶向治疗。然而，一方面只有40%～60%的患者对这些抗癌药物有反应，另一方面即使对抗癌药物有反应的患者也不可避免地进一步恶化，故其整体中位生存期通常不超过2～2.5 年[1]。导致抗癌药物疗效低下的最主要原因是抗癌药物的耐药性。因此，发现一种具有抗肿瘤作用、且可有效改善传统抗癌药物耐药性的新药物迫在眉睫。

冬凌草甲素（oridonin）是冬凌草的叶子中提取出的一种贝壳杉烯二萜类化合物，具有抗炎、神经保护、抗菌及较好的抗肿瘤活性作用[2-4]。近期发现，冬凌草甲素对前列腺和乳腺癌、非小细胞肺癌、急性白血病、多形性成胶质细胞瘤以及人类黑色素瘤等多种恶性肿瘤均有抑制作用[5-9]，但关于是否能抑制转移研究却寥寥无几。虽然Zheng 等[10]证实冬凌草甲素可通过诱导坏死性凋亡而增强5-FU 的细胞毒性，Xu 等[11]发现冬凌草甲素通过凋亡基因而增强香菇多糖对SMMC-7721人肝细胞瘤细胞的抗癌效果，但对冬凌草甲素联合奥沙利铂治疗结肠癌肝转移还未有报道。因此，本课题以裸鼠结肠癌肝转移模型的建立方式，研究冬凌草甲素与奥沙利铂联合应用对裸鼠结肠癌肝转移模型的转移抑制。

1 材料和方法

1.1 材料 冬凌草甲素购自普思生物科技有限公司，与二甲亚砜配制成0.1 mol/L 储存液备用；奥沙利铂购自江苏恒瑞股份有限公司；HT29 人结肠癌细胞株由大连大学附属新华医院中心实验室传代捐助；BALb/c 品系裸鼠24 只，6 周龄雌性，体质量18～20 g，由大连医科大学实验动物研究中心购买。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HT29 人结肠癌细胞株接种于100 mm培养皿中，并在37 ℃、5% CO2，含10%牛血清的RPMI 1640培养液中传代培养，每2～3 d换1次培养液。培养至80%～90%融合后，利用0.25%胰酶消化液消化，1 200 r/min 离心3 min，丢弃上清液，加无血清RPMI1640 培养液洗细胞2 次，显微镜下计数。制备成细胞浓度为5×107/mL 的混悬液，待行动物模型中备用。

1.2.2 动物模型设计 制模前1 周为稳定期，减少一切刺激；1 周后，利用HT29 人结肠癌细胞株建立稳定型裸鼠肝转移模型[12]24 只；1 周后，按尾静脉注入成分不同，随机分成6 只冬凌草甲素单一应用组[100 mg/（kg·d），OD 组]、6 只奥沙利铂单一应用组[5 mg/（kg·d），Oxa 组]、6 只冬凌草甲素与奥沙利铂联合应用组[OD-100 mg/（kg·d）plus Oxa-5 mg/（kg·d），OD 加Oxa 组]及6 只对照组（RPMI 1640 100 μL，Control 组）；分组制模3 周后处死，并观察各组情况。

1.2.3 实验观察指标 每天常规观察记录裸鼠状态，结肠癌肝转移模型4 周或分组制模（药物干预模型）3周后，各组裸鼠进行脱颈处死。首先解剖观察肝质量、血性腹水、胆汁淤积及肝转移评分[13]，其次观察局部浸润发生率、淋巴结转移率及腹膜种植转移率，同时观察胸腔内、颅内有无转移情况。所有肉眼可疑部位照相并取材，行病理学检查。

1.2.4 统计学方法 利用SPSS 20.0 统计软件包进行处理，2 组计量资料比较采用t检验，2 组计数资料比较均采用χ2检验。

2 结果

各组裸鼠结肠癌肝转移模型成功率为100%（24/24）。与Control 组相比，OD 组、Oxa 组及OD加Oxa 组均可显著降低或减少肝质量、血性腹水、胆汁淤积及肝转移评分，而OD 加Oxa 组更能显著抑制肝转移形成，差异有统计学意义（P＜0.05）。Control组局部浸润发生率、淋巴结转移率及腹膜种植转移率有增高趋势，但其差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 分析各组裸鼠结肠癌肝转移模型（n=6）

3 讨论

奥沙利铂是临床治疗结直肠癌肝转移最常用的化疗药物，可显著改善患者的总体生存期[14-15]。然而，奥沙利铂耐药却是导致结直肠癌肝转移患者预后不良以及化疗失败的主要因素。奥沙利铂耐药主要与增加药物外流、改善基本切除修复功能以及增强谷胱甘肽和金属蛋白酶的脱毒能力等几个方面有关[16-17]。因此，可阻断药物外流、恢复癌细胞凋亡程序和损坏DNA修复活动的表皮生长因子络氨酸激酶抑制剂西妥昔单抗和帕尼单抗被成功用于治疗对奥沙利铂耐药的结直肠癌肝转移患者，且西妥昔单抗已被美国食品和药物管理局（FDA）批准用于治疗进展期结肠癌[18]。但癌细胞耐药性的出现往往涉及多个不同机制，而且这些耐药机制还会随着疾病和治疗的进展不断变化，所以仅作用于单一耐药机制的传统靶向药物不足以完全逆转癌细胞的耐药性[19]。此外，西妥昔单抗虽已被批准用于临床，但仅对野生型KRAS 结直肠癌肝转移患者有效，且长期使用同样会出现耐药，故而临床应用价值十分受限。因此，研发一种具有抗肿瘤活性、可作用于多个耐药机制以增强奥沙利铂敏感性的新型药物对结直肠癌肝转移治疗将具有十分重要的临床价值和意义。

与传统抗癌药物相比较，冬凌草甲素具有以下几大优势：1）冬凌草甲素可选择性诱导肿瘤细胞分化和凋亡，而对正常细胞不造成任何负面影响。因此，冬凌草甲素在不损伤骨髓、肝及肾等人体重要脏器的同时，能有效的抑制和杀伤肿瘤细胞[20]。2）冬凌草甲素可作用于多个信号通路诱导癌细胞死亡。Liu 等[21]揭示冬凌草甲素可通过上调BMP-7 而激活p38MAPK信号通路，从而抑制结肠癌HCT116 细胞的增殖以及诱导癌细胞凋亡；Zheng 等[10]报道冬凌草甲素可通过激活JNK、P38 和ERK 而诱导肾癌786-O 细胞坏死性凋亡，因而增强5-FU 的细胞毒性作用；而且近期熊朝刚等[22]还证实冬凌草甲素可通过上调RIP1 和RIP3而诱导结肠癌HT29 细胞发生坏死和凋亡，从而增强5-FU 对结肠癌HT29 细胞的毒性作用。这些发现提示冬凌草甲素可作用于不同的信号通路来恢复癌细胞凋亡程序从而增强其对氟尿嘧啶的敏感性。因此，笔者推断冬凌草甲素或许也能作用于多种不同的耐药机制或信号通路来改善结直肠癌肝转移癌细胞对奥沙利铂的耐药性；3）龙景培等[23]已经证实冬凌草甲素可调结Wnt/β-catenin 信号通路来上调细胞内E-cadherin 的表达、下调Vimentin 的表达，从而抑制结肠癌细胞的增殖、EMT 过程以及肿瘤侵袭和转移。本研究首次发现冬凌草甲素或奥沙利铂单药皆可抑制结直肠癌肝转移，且二者联合药物干预可大幅度增加转移抑制效果。该结果证实冬凌草甲素不仅可抑制结直肠癌肝转移，亦能增强癌细胞对奥沙利铂的敏感性，改善癌细胞对奥沙利铂的耐药性。

尽管冬凌草甲素在恶性肿瘤治疗方面优势显著，但效能低且半衰期短的药学特性极大的限制了该药的临床应用。因此，许多策略正被研发来解决这一缺陷，结构修饰就是其中一种。近年来，许多学者在这方面取得了令人鼓舞的进展。Wang 等[24]研发的冬凌草甲素衍生物Geridonin 可通过增加细胞内ROS 而诱导胃癌MGC803 细胞凋亡，该衍生物的毒性作用明显强于冬凌草甲素。近期Shen 等[25]合成的另一种冬凌草甲素衍生物compound C7 能显著抑制HCT116 癌细胞的增殖，且其临床效能是冬凌草甲素的43 倍。本实验组结合现阶段的实验结果以及现有的相关理论，为了更好的将冬凌草甲素的优势运用于结直肠癌肝转移的治疗，一方面会继续进行动物实验深入阐明冬凌草甲素与奥沙利铂的协同作用机理及分子机制，另一方面将着手开展冬凌草甲素衍生物的相关研究。在后续的实验中，若能于以上两个方面取得重大突破，将会极大的推动冬凌草甲素与奥沙利铂联合治疗在结直肠癌肝转移治疗中的应用。

综上所述，本研究首次通过构建裸鼠结肠癌肝转移模型，在in vivo 平台上阐述了冬凌草甲素及其联合应用对裸鼠结肠癌肝转移模型的抑制效果。冬凌草甲素与奥沙利铂联合药物干预可大幅度增加转移抑制效果，至于具体的转移机制有必要进行临床试验的量化指标来判定转移抑制效果。