酵母双杂交筛选与星状病毒衣壳蛋白ORF2互作的宿主蛋白

李香雨，于漫，聂梓陶，陈彦如，王嘉会，韩喜彬，赵微

（锦州医科大学基础医学院实验动物学教研室，辽宁 锦州 121200）

星状病毒是引起婴幼儿及免疫缺陷人群腹泻的重要病原体，发病率仅次于轮状病毒，常与其他肠道病毒混合感染，造成患儿严重腹泻甚至死亡［1］。由于星状病毒属于食源性和医院获得性病原体，常呈现群体爆发感染，严重危害公共卫生安全［2-3］。

星状病毒为星状病毒科无囊膜、单股、正链RNA病毒。人星状病毒（human astrovirus，HAstV）具有8个传统的血清型（HAstV 1～8）及3种新的亚型（MLB型、VA型及HMO型）［4］。其中，HAstV-1型在婴幼儿群体中感染最为普遍［5］。HAstV基因组编码非结构蛋白nsP1a（编码3C-like 丝氨酸蛋白酶）、非结构蛋白nsP1b（编码RNA依赖性的RNA聚合酶RdRp）和结构蛋白ORF2（编码病毒衣壳蛋白）3种蛋白。ORF2蛋白主要决定了细胞的嗜异性，并能够刺激宿主细胞产生应答，是参与调控细胞基因的转录与表达及参与病毒受体结合的重要成分，在病毒粒子的成熟和包装中起重要作用［6-8］，因此，以ORF2为靶基因筛选与之互作的蛋白具有重要意义。

酵母双杂交系统是基于转录因子对细胞内蛋白质相互作用进行筛选与鉴定的系统，已被广泛应用于病毒与宿主的互作研究［9-10］。本研究利用实验室分离到的HAstV-1型1d亚株作为模板，将病毒衣壳蛋白ORF2基因成功克隆到酵母双杂交表达载体pGBKT7中，并以ORF2作为诱饵蛋白，从人结肠癌细胞Caco-2 cDNA文库中初步鉴定与ORF2存在相互作用的宿主蛋白，为进一步研究ORF2的生物学功能及参与病毒致病性等方面奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

HAstV-1d病毒株、人Caco-2 cDNA 文库、Caco-2细胞、pMD-18T-ORF2质粒为本实验室保存。Y2H 酵母感受态细胞、胶回收试剂盒、Prime STAR HS DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶NdeⅠ、SalⅠ、T4DNA连接酶、DNA Marker、2×蛋白上样缓冲液，均购自大连TaKaRa公司；质粒pGBKT7、pGBKT7-53、pGADT7、pGADT7-T、酵母质粒小提试剂盒和酵母双杂交试剂盒及各种营养缺陷型培养基均购自美国Clontech公司；Lipofectamine3000转染试剂、ECL发光试剂盒购自美国Thermo 公司；胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶购自美国GIBCO 公司。

1.2 方法

1.2.1 构建pGBKT7-ORF2诱饵表达载体：以HAstV-1d病毒株衣壳蛋白pMD-18T-ORF2质粒作为模板，设计针对ORF2的PCR引物，ORF-F引物序列为5’-CA TATGATGGCTAGCAAGTCCAATAAGCAGGTAA CT-3’；ORF-R引物序列为5’-GTCGACCTCGGCGTG GCCGCGGCTTCCAGAAGT-3’。分别用Prime STAR HS DNA聚合酶进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶检测、回收，用 NdeⅠ和SalⅠ对PCR产物和pGBKT7质粒分别进行双酶切、鉴定、回收。再经T4 连接酶连接并转化DH5α感受态细胞。用检测引物ORF-F和ORF-R对得到的转化子进行菌落PCR扩增，1%琼脂糖凝胶检测，并将阳性转化子送上海杰李公司进行测序。

1.2.2 诱饵蛋白自激活性鉴定：将pGBKT7-ORF2和pGADT7共转化至Y2H Gold中，以pGADT7-T和pGADT7-53作为阳性对照、pGBKT7-Lam 和pGADT7-T作为阴性对照。转化菌液于SD/-Leu/-Trp和SD/-Leu/-Trp/-His固体培养基上划线，30 ℃培养3～5 d。观察是否有蓝色克隆菌生长，判断是否有自激活及毒性作用。

1.2.3 酵母双杂交筛选与鉴定：酵母双杂交筛选按照说明书进行。将诱饵质粒pGBKT7-ORF2转化至Y2H酵母感受态细胞，并接种到全培养基中，30 ℃培养24 h，OD600值达到1时收集细胞。用5 mL SD/-Trp液体培养基进行重悬，加入 1 mL Caco-2 cDNA 文库（克隆数＞2×107）。培养 24 h 后，取少许菌液在显微镜下观察菌体形态，判断是否融合。将融合的菌液涂布于SD/-Trp/-Leu/-His培养基进行初步筛选，获得的阳性菌落涂布于 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 固体培养基上，30 ℃培养3～5 d，进行第二次筛选。挑选二次筛选到的阳性菌落接种到 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/AbA/X-α-gal培养基，30 ℃培养 3～5 d，进一步筛选。阳性菌落，经菌液 PCR 扩增ORF2基因，回收后送上海杰李公司进行序列测定。获得的序列信息在NCBI数据库中进行检索与对比，确定互作蛋白的基因序列信息。

2 结果

2.1 酵母诱饵质粒pGBKT7-ORF2的鉴定

用ORF-R与ORF-F引物对已构建好的重组质粒pGBKT7-ORF2进行菌落PCR检测，可扩增出2 364 bp的片段（图1A），测序结果与HAstV-1d上传 GenBank的ORF2基因片段（GenBank：KF211475.1）序列一致，说明pGBKT7-ORF2诱饵质粒构建成功。重组质粒经双酶切鉴定、琼脂糖凝胶电泳检测，出现大小为2 364 bp目的条带（图1B），与预期相符。

图1 诱饵载体pGBKT7-ORF2的鉴定Fig.1 Detection of bait plasmid pGBKT7-ORF2 by PCR

2.2 诱饵质粒自激活和毒性检测

pGBKT7-ORF2和pGADT7、pGADT7-T和pGADT7-53（阳性对照）、pGBKT7-Lam 和pGADT7-T（阴性对照）菌落均能在SD/-Leu/-Trp固体培养基上生长，而仅有pGADT7-T和pGADT7-53在SD/-Leu/-Trp/-His固体培养基上生长，其余均无菌落生长（图2）。说明ORF2蛋白不能激活酵母菌下游基因，不具有自激活性。

将含pGBKT7-ORF2和pGBKT7质粒的Y2H酵母菌涂布于SD/-Leu/-Trp 培养基培养3 d，结果显示，pGBKT7-ORF2重组菌与空载体pGBKT7的菌落大小和数量基本一致（图2B、2C），表明ORF2蛋白对菌体明显无毒性。

图2 诱饵质粒自激活和毒性检测Fig.2 Toxicity and the activation test of pGBKT7-ORF2

2.3 筛选与ORF2 蛋白互作的宿主蛋白

将pGBKT7-ORF2转化的Y2H酵母菌和Caco-2 cDNA文库融合得到的菌液涂布于不同报告基因缺失的固体平板进行表型鉴定（图3A）。经过4轮缺失培养基筛选获得克隆，将Caco-2细胞cDNA文库转化产物104倍稀释后，在SD/-Trp/-Leu培养基平板进行培养，得到了14个阳性克隆菌（图3B），总筛选克隆数为1.4×105。

图3 以pGBKT7-ORF2为诱饵筛选Caco2细胞cDNA文库Fig.3 Screening of Caco2 cell cDNA library

2.4 阳性克隆菌的回转验证及测序分析

对获得的阳性克隆菌行2次回转验证，结果显示，转化的菌株能够在 SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上生长，且在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/Aba平板上菌落呈蓝色，与阳性对照结果一致（图4）。经测序鉴定得到阳性菌的基因序列，与NCBI数据库中数据进行比对分析，获得15种蛋白，见表1。

表1 酵母双杂交系统筛选与ORF2互作的蛋白质Tab.1 Screening of proteins interacting with ORF2 by yeast two-hybrid system

图4 阳性克隆回转验证Fig.4 Return test of pGBKT7-ORF2 proreins

3 讨论

星状病毒ORF2蛋白主要决定了细胞的嗜异性，并能够刺激宿主细胞产生应答，参与病毒粒子的装配、核酸的包装、病毒粒子的成熟［11-12］。目前关于星状病毒衣壳蛋白与宿主相互作用的报道较少，通过对其结构基因的预测表明，ORF2蛋白的C端与某些病毒相关蛋白和受体具有结构上的相似性［13］，可能参与病毒与受体的结合。

星状病毒的宿主细胞为Caco-2，该细胞体外培养条件下可自发上皮样分化，形成与小肠上皮细胞相同的微绒毛结构和紧密连接，与小肠柱状上皮细胞很相似。因此，本研究选择Caco-2细胞构建cDNA文库，进行宿主蛋白筛选［14］。以星状病毒的ORF2蛋白作为诱饵蛋白，通过酵母双杂交系统在Caco-2细胞的cDNA文库中筛选出与ORF2蛋白互作的15种蛋白。对15种蛋白进行了初步功能分析和文献检索，其中，纤维连接蛋白1（fibronectin 1，FN）与病毒感染具有相关性［15］。FN1的细胞型是细胞外基质的重要组成部分，在细胞形态形成、迁移、炎症和表面受体内化等方面发挥作用［16-18］。文献［19］报道，FN与EV71 病毒颗粒有直接的相互作用，通过促进EV71的入侵促进EV71的感染。而流感病毒H1N1入侵宿主时需要FN的参与［20］。FN能与乙型肝炎病毒（hepatitis B，HBV）的S抗原相互作用，促进其与细胞表面结合［21-22］，并且还可能参与HBV的入侵［23］。而FN1与星状病毒互作后对病毒感染有何影响目前尚无报道，有待进一步深入研究。

本研究利用酵母双杂交系统筛选并鉴定出与HAstV-1 ORF2蛋白互作蛋白。后续将进一步对其中感兴趣的蛋白，尤其是FN1与ORF2的互作进行免疫共沉淀检测，并进行基因功能分析，为研究星状病毒与宿主相互作用、ORF2蛋白功能及病毒的致病机制奠定基础。