活化部分凝血活酶时间检测狼疮抗凝物的灵敏度及其相关性

张家红，王金行，夏楠，李花

（中国医科大学附属第一医院检验科，沈阳 110001）

活化部分凝血活酶时间（activated partial thrombo-plastin time，APTT）凝血试验是将待测血浆和接触凝血因子激活剂、磷脂、氯化钙混合，记录血浆凝固的时间，通常用于筛查内源性和共同凝血途径的凝血障碍。狼疮抗凝物（lupus anticoagulant，LA）是一种能与带负电荷的磷脂或磷脂蛋白复合物结合的免疫球蛋白，属于抗磷脂抗体（antiphospholipid antibody，APL），可干扰依赖磷脂的体外凝血反应［1］，其机制为血浆中的LA能中和APTT试剂中的磷脂，导致凝血反应所需的磷脂量减少，凝血时间延长［2］。一般情况下，对于常规凝血试验中的APTT单独延长，首先应进行APTT纠正试验，以区分内源凝血因子缺乏或存在凝血抑制物，如怀疑为后者，则进一步检测LA或其他APL。然而，在实际工作中，APTT和LA同时检测时，有相当比例的患者APTT正常而LA阳性，而且制造商的试剂说明书中未标明APTT对LA的灵敏度，这可能给部分临床医生或检测人员造成困扰。本研究拟回顾分析改良的稀释蝰蛇毒时间（diluted Russell viper venom time，DRVVT）法和硅凝固时间（silica clotting time，SCT）法检测LA阳性且同时行常规APTT检测的样本数据，旨在评估本实验室APTT对LA检测的灵敏度和相关性，以期为临床提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象及分组

根据电子病历和实验室信息系统，收集2018年12月至2020年9月于中国医科大学附属第一医院就诊的LA阳性病例386例，其中男62例，女324例，年龄9～87岁，中位年龄40（28～55）岁。386例LA阳性患者均同时进行了APTT检测，根据APTT参考区间（32.0～43.0 s）进行分组：APTT正常（≤43.0 s）组177例，其中男28例，女149例；APTT延长（＞43.0 s）组209例，其中男34例，女175例。排除凝血因子缺乏、含凝血因子抗体、凝血酶时间延长、应用抗凝药物、肝病、血液病等。

1.2 样本制备

采用含有0.3 mL浓度为0.109 mol/L的枸橼酸钠抗凝剂的负压采血管采取静脉血2.7 mL（抗凝剂和血液的比例为1∶9），充分混匀。检测APTT的采血管以2 000～2 500g离心10 min；检测LA的采血管以2 000～2 500g离心10 min，且离心2次，检测血浆均为乏血小板血浆样本（血小板计数＜10×109/L）。

1.3 仪器、试剂与方法

1.3.1 APTT检测：采用法国STAGO公司STA-REvolution仪器及相关配套试剂检测APTT，试剂为冻干粉，激活物为硅土，含有标准数量的兔脑磷脂。

1.3.2 LA检测：采用美国IL公司TOP-750及相关配套试剂DRVVT法和SCT法检测LA，2种方法均采用配套成对（筛选和确认）试剂。DRVVT配套成对试剂为冻干粉，激活物为蝰蛇毒，筛选试剂和确认试剂分别含有低浓度和高浓度的双层磷脂。SCT配套成对试剂均为液体，激活物为硅胶，开瓶使用前将SCT确认试剂充分混匀后吸取50 μL加入筛选试剂中，筛选试剂和确认试剂分别含有低浓度和高浓度的合成磷脂。2种检测LA方法的结果均以标准化比值（normalized ratio，NR）表示（筛选试验比值=筛选试验凝血时间/正常血浆凝血时间均值，确认试验比值=确认试验凝血时间/正常血浆凝血时间均值，NR=筛选试验比值/确认试验比值，其中正常血浆来自40人份18～50岁的健康人群）。判定标准：DRVVTNR和SCT-NR任意一种方法的NR≥1.2即为LA阳性，1.2≤NR＜1.5为LA弱阳性，1.5≤NR＜2.0为LA中等阳性，NR≥2.0为LA强阳性。

1.4 统计学分析

应用SPSS 22.0及GraphPad Prism.7.0软件进行统计学分析、作图。2组DRVVT-NR及SCT-NR均为非正态分布，以M（P25～P75）表示，组间数据比较采用非参数Mann-WhitneyU检验，采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析DRVVT-NR和SCT-NR预测APTT延长的临界值、敏感度和特异度，采用Spearman秩相关方法分别分析APTT与DRVVT-NR及SCT-NR的相关性，计数资料比较采用χ2检验。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 386例LA阳性患者的疾病类型特征和样本的基本参数比较

386例LA阳性患者的疾病类型包括以下4种：（1）血栓疾病，包括抗磷脂综合征（62例）、肾静脉血栓（1例）、主动脉血栓（1例）、动脉血栓颅内占位病变（1例）；（2）结缔组织病，包括系统性红斑狼疮（186例）、类风湿关节炎（27例）、干燥综合征（30例）、血管炎（7例）、皮肌炎（3例）、硬皮病（3例）、其他结缔组织病（36例）；（3）病理妊娠，包括习惯性流产（3例）、宫内胎儿发育停滞（1例）；（4）其他免疫性疾病，包括免疫性血小板减少（21例）、成人Still病（4例）。

APTT正常组与APTT延长组患者的性别、年龄、凝血酶原时间、纤维蛋白原、凝血酶时间及D-二聚体比较，均无统计学差异（P＞ 0.05）；2组DRVVT-NR和SCT-NR比较，差异有统计学意义（P＜ 0.01）。见表1、图1。

图1 2组NR的比较Fig.1 Comparison of NR in 2 groups

表1 386例LA阳性患者标本各参数比较［M （P25～P75）］Tab.1 Comparison of parameters of 386 LA positive patients［M （P25-P75）］

2.2 ROC曲线分析

以APTT异常为判定标准，ROC曲线分析显示，DRVVT-NR和SCT-NR预测APTT异常的临界值分别为1.39和1.83，即APTT试验对2种LA检测方法灵敏度DRVVT-NR效能略高于SCT-NR。见表2、图2。

图2 DRVVT-NR和SCT -NR预测APTT延长ROC曲线Fig.2 Curve of DRVVT-NR and SCT -NR predicting APTT abnormal ROC

表2 NR预测APTT异常的ROC曲线分析Tab.2 ROC curve analysis of NR predicting abnormal APTT

2.3 APTT与DRVVT-NR及SCT -NR的相关性

采用Spearman秩相关方法，APTT与DRVVT-NR及SCT-NR的相关系数分别为0.702、0.641（P＜ 0.01）。见图3。

图3 APTT与DRVVT-NR及SCT-NR相关散点图Fig.3 APTT and DRVVT-NR、SCT-NR correlation scatter diagram

3 讨论

LA作为一种APL，目前不能定量检测，是在排除其他可能的原因后通过推断“检测”到的，是一种功能性试验［3］。由于目前尚无单一的检测系统可以检测到所有的LA，需要进行2种不同检测原理的试验，以最大限度地提高其阳性检出率［3-5］。本研究中，采用DRVVT和SCT两步法检测LA，其原理是应用含有低浓度磷脂试剂的筛选试验和含有高浓度磷脂试剂的确认试验。若血浆中存在LA，筛选试验凝血时间延长，而确认试验则可完全中和血浆中的LA，使凝血时间缩短，结果显示NR增高，提示LA存在。理论上，任何依赖于磷脂的试验均适用于LA检测。某些情况下，部分临床医生或实验室人员可能会认为LA阳性时APTT势必延长，反之，APTT正常即可排除LA的存在。针对APTT和LA的关系，北美专业凝血实验室协会的1项调查研究［6］显示，多数实验室LA检测的灵敏度采用常规APTT评价，69%的实验室反对“APTT正常即排除LA的存在”这一说法，31%的实验室并不了解LA检测的具体要求。本研究结果显示，386例LA阳性样本中，有45.9%APTT正常，故APTT正常并不能完全排除LA的存在。因此，正确解读APTT和LA之间的关系可为临床医生提供有价值的咨询。

常规凝血筛查用APTT试剂主要用于检测凝血因子缺陷和肝素治疗监测，因含有的磷脂为非稀释浓度磷脂和（或）合适的磷脂成分，影响其对LA的灵敏度［7］。APTT试剂中的磷脂类型、浓度及激活剂类型均可影响LA测定的灵敏度［8］。然而，KUMANO等［9］认为LA测定的灵敏度依赖于磷脂浓度，与激活剂无关。通常在LA存在的情况下，与受LA影响的试剂相比，对LA不十分敏感的试剂所测得的凝血时间更短［10］。本研究中，APTT正常组的DRVVT-NR和SCT-NR多为弱阳性或中等阳性（表1、图1），说明APTT对阳性程度不高的LA不敏感，这可能与APTT试剂含有标准浓度的磷脂有关。然而，有10例样本LA强阳性，APTT却在正常范围内；有的样本APTT明显延长，DRVVT-NR和SCT-NR升高程度差异却很大（图3），提示除了和APTT试剂的磷脂浓度和组成不同有关外，也可能跟LA的异质性有关。有研究［11］报道，APTT试剂不变的情况下，不同LA的APTT延长程度差异很大。这种异质性加上试剂间的可变性，可能导致在LA不变的情况下，用一种试剂检测呈强阳性，而用另一种试剂检测则呈弱阳性甚至阴性［7］。

既往文献［11-12］评估APTT对LA的灵敏度多为同一水平LA阳性样本采用多种试剂检测，比较不同试剂的APTT值或其与正常APTT的比值，APTT值或其比值越高说明该试剂对LA越敏感，但这种灵敏度是相对的，不能提供APTT延长时LA的具体临界值。本研究采用ROC曲线分析，通过DRVVT-NR和SCT-NR预测APTT延长时的临界值（分别是1.39和1.83），即LA水平来反映APTT试验的LA灵敏度，临界值以下APTT试验不敏感，反之则敏感（表2、图2）。本研究结果还表明，APTT与DRVVT-NR和SCT-NR相关程度较强，呈显著正相关（图3）。YAO等［13］将大于APTT参考范围10 s定为异常值，其异常程度与DRVVT、SCT显著相关，相关系数分别为0.437、0.497（P＜0.01），与本研究结果相似。

由于LA的检测尚无金标准，LA阳性定义为同一份血浆样品基于DRVVT和（或）SCT的NR阳性结果，不能排除LA假阳性或假阴性。本研究存在一定的局限性，如APTT、DRVVT筛选和确认试剂的说明书中未提供有关磷脂的具体浓度，只以粗略的标准浓度表示，而SCT成套配对试剂开瓶使用前需将SCT确认试剂充分混匀后吸取50 μL加入筛选试剂中，故而认为筛选试剂中所含磷脂浓度较低，确认试剂中所含磷脂浓度较高，可能造成一定的人为因素干扰；另外，作为回顾性研究，通过电子病历和实验室信息系统采集的信息可能存在回顾性信息偏倚。

综上所述，在LA阳性样本中，常规APTT试剂和检测LA的DRVVT、SCT试剂磷脂的浓度、组成不同以及LA的异质性均可能导致对LA检测的灵敏度不同。了解实验室APTT试剂对LA检测的灵敏度及其相关性，合理解释APTT与LA检测结果之间的关系，具有实际临床应用价值。