蒲金口服液对宫内感染/炎症致早产脑损伤大鼠脑组织NgR、p75NTR表达的影响

张 晰，马丙祥，张建奎，王怡珍，陈恬恬，李华伟，党伟利，周荣易

（河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000）

随着现代医学技术的发展，早产儿存活率较前有大幅提高［1]，但早产儿脑损伤发生的风险并无下降，一项Meta分析表明，早产、低体质量、宫内感染、缺氧等因素均是我国早产儿脑损伤的危险因素［2]，其中宫内感染显著提高了早产儿脑损伤发病率［3-4]，是造成胎膜早破引发早产、低体重的主要原因之一［5]，故早产儿脑损伤与宫内感染关系密切［6]。早产儿神经系统发育不完善，其主要损伤类型包括脑室周围白质软化（periventricular leukomalacia，PVL）、脑室周围-脑室内出血、蛛网膜下腔出血、缺氧缺血性脑病等［1，7]，遗留神经后遗症的风险较高，这同时也增加了脑性瘫痪（cerebral palsy，CP）发生的几率［8]。CP 是早产儿脑损伤最常见的神经系统后遗症，临床表现为姿势发育障碍、活动受限，常伴有感知觉异常、认知障碍等多种问题［9]。CP 的治疗并无特效药物，需要多专业联合终身康复，这给家庭及社会带来了沉重的负担［10]。故探索宫内感染致早产脑损伤的早期干预药物，尽可能在疾病早期减轻神经系统的损伤，显得尤为重要。

蒲金口服液为河南中医药大学第一附属医院儿科马丙祥教授的经验方，由石菖蒲、郁金、丹参、红花四味中药组成，本方经过大量的临床应用，临床验证有效。方中石菖蒲为君药，宣气豁痰开窍，醒神益智；臣以丹参，以活血祛瘀生新；辅以红花、郁金二味，加强君臣活血行气通络破积之功。临床观察发现，蒲金颗粒治疗小儿痉挛型脑瘫痰瘀阻窍证，可有效改善脑瘫患儿粗大运动功能、肌张力、智力、言语、中医证候评分［11]。实验证实，蒲金口服液能有效降低缺氧缺血性脑损伤大鼠脑组织一氧化氮合酶（NOS）水平，对抗氧自由基［12-13]，降低宫内感染致早产PVL 大鼠脑组织TNF-α、IL-6 炎性因子表达，抑制少突胶质细胞（OL）及其前体细胞（OPC）的凋亡，下调髓鞘轴突生长抑制因子（Nogo）-A、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白（OMgp）等髓鞘相关抑制因子（myelin-associated inhibitor factors，MAIFs）的表达［14-16]，改善神经损伤症状。为进一步探索本药的作用机制，本实验采用宫内感染致早产PVL仔鼠模型，通过高、低剂量蒲金口服液在不同时期干预，检测仔鼠脑组织勿动蛋白受体（nogoreceptor，NgR）和神经营养素受体（p75 neurotrophin receptor，p75NTR）的表达量，观察蒲金口服液对NgR、p75NTR 表达的影响，进一步探索其可能的作用机制。

1 材料

1.1 动物 SPF 级成熟SD 雌性大鼠36 只，体质量（250±50）g；成熟SD 雄性大鼠18 只，体质量（300±50）g，分笼喂养，自由饮水进食，按时通风，实验室温度控制在20～27 ℃，相对湿度控制在40%～70%，定期更换垫料，清洗笼具，消毒，保持动物房的安静环境，由郑州大学动物实验中心提供，动物生产许可证号SCXK（豫）2015-0004。实验通过河南中医药大学第一附属医院动物伦理委员会的批准（编号YFYDW2016022）。

1.2 药物及试剂 蒲金口服液含石菖蒲、郁金、丹参、红花四味中药，成药制作工艺由河南中医药大学第一附属医院制剂研究室提供，低剂量组含生药1.2 g/mL，高剂量组含生药2.4 g/mL；银杏叶提取物（德国威玛舒培博士药厂，批号7140315）；脂多糖（LPS 血清型O55：B5，北京索莱宝科技有限公司，批号530F035）；兔多抗NgR（北京博奥森生物技术有限公司，批号bs-20486R）；兔多抗p75NTR（武汉三鹰生物技术有限公司，批号55014-1-AP）；小鼠单抗βactin（武汉博士德生物工程有限公司，批号BM0627）。

1.3 仪器 EG1150 型全自动石蜡包埋机、2016 型轮转式切片机（德国Leica 公司）；BX53 型生物显微镜（日本Olympus 公司）；HI650 型离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；DYCZ-24DN 型垂直电泳槽（北京六一仪器厂）；Muliskan MK3 型酶标仪（美国Thermo 公司）等。

2 方法

2.1 模型制备与分组 将36 只SD 雌性大鼠与18 只雄性大鼠以2∶1 比例于下午17：00 合笼，次日上午08：00 将雌雄大鼠分笼，受孕成功后孕鼠另笼饲养。将受孕大鼠随机分为LPS 组（30 只）与对照组（6 只）；参照李晓捷等［17]制作宫内感染致早产鼠脑性瘫痪动物模型的方法，LPS 组于妊娠第16、17 天连续2 d 每日腹腔注射LPS（350 μg/kg），对照组注射同等剂量的生理盐水；以孕期≤21 d 判定为早产造模成功。随机选取LPS 组早产模型仔鼠80 只，随机分为4 组，每组20 只，分为蒲金口服液高剂量（24 g/kg）组、蒲金口服液低剂量（12 g/kg）组、银杏叶提取物（30 mg/kg）组、模型组，分别给予高剂量蒲金口服液、低剂量蒲金口服液、银杏叶提取物及生理盐水灌胃。4 组各随机分为早期、晚期干预组各10 只。

2.2 药物干预 早期干预组于生后第1 天灌胃给药；晚期干预组生后第8 天灌胃给药；灌胃容量为0.1 mL/10 g，连续7 d，每日1 次。同条件喂养至21 日龄。剂量换算方法根据徐淑云《药理实验方法学》 所述人与动物间体表面积折算，按照说明书用药剂量折算出大鼠用量，把人的等效剂量记为低剂量，2 倍等效剂量记为高剂量。

2.3 模型病理学观察及组织病理学评分

2.3.1 孕鼠宫内感染 仔鼠出生即刻随机选取LPS 组和对照组孕鼠各4 只，取子宫及胎盘，组织固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，HE 染色，观察孕鼠宫内感染情况。对孕鼠子宫组织参照刘国生等［18]的方法进行病理学评分，①腔壁结构病变，“-”各层结构正常记0 分，“+”黏膜固有层腺体结构消失记1 分，“++”肌层与黏膜层分界不清记2分，“+++”分层结构不清记3 分；②上皮细胞变性坏死，“-”单层柱状上皮记0 分，“+”上皮细胞扁平或脱落＜1/3 记1 分，“++”上皮细胞扁平或脱落1/3～2/3 病变记2分；“+++”全层上皮细胞变性坏死记3 分；③炎细胞侵润，“-”无炎细胞侵润记0 分，“+”小数散在或灶性且仅在黏膜固有层内记1 分，“++”散在或灶性但深入肌层记2分，“+++”多数散在或层状浸润并累及全层记3 分；④内膜充血水肿，“-”无内膜充血水肿记0 分，“+”固有膜轻微充血水肿记1 分，“++”明显充血水肿记2 分，“+++”全层充血水肿记3 分。

胎盘组织从血管充血、水肿及炎性细胞浸润程度方面进行评分，0 分为无损伤，1 分为病变范围＜25%，2 分为病变范围25%～50%，3 分为病变范围51%～75%，4 分为病变＞75%，总分8 分。

2.3.2 新生仔鼠脑组织脑室旁白质区损伤 随机选LPS 组早产仔鼠及对照组仔鼠各10 只，断头取脑组织，进行组织固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，HE 染色，观察新生仔鼠脑组织脑室旁白质区损伤情况。采用孔雷等［19]的方法每张切片随机选择10 个高倍视野（×200），光镜下对脑组织神经元、胶质细胞和血管分别作组织学评分。出现少量神经元、神经纤维水肿等计1 分，散在星形胶质细胞水肿计1 分，部分毛细血管扩张、水肿计1 分；出现广泛神经元水肿、神经纤维疏松化，胞核形态不规则，核固缩、神经元凋亡，神经纤维网结构破坏计2 分；广泛胶质细胞水肿计2 分；广泛毛细血管扩张及水肿、毛细血管内皮细胞破坏计2 分；出现核固缩、神经元凋亡计3 分；嗜神经元现象，脑脓肿计3 分；毛细血管坏死，脑实质内点、片状出血计3 分，总分为18 分。

2.4 脑组织NgR、p75NTR 表达的检测 随机取LPS 组及对照组新生仔鼠各10 只断头取脑，取一侧脑组织进行组织固定、脱水、透明、浸蜡、包埋。取另一侧脑组织放置于2 mL 冻存管内，并快速放入液氮罐内冻存备用，分别进行免疫组化染色及Western blot 检测。同样方法取21 日龄80 只模型仔鼠脑组织，分别进行免疫组化及Western blot 检测。

2.4.1 免疫组化检测 石蜡切片常规脱蜡至水，热抗原修复，过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，5% BSA 封闭，滴加稀释的兔抗大鼠NgR 多克隆IgG 一抗/兔抗大鼠p75NTR多克隆IgG 一抗（1∶50/1∶50），生物素标记山羊抗兔IgG/p75NTR 二抗，37 ℃恒温箱孵育20 min；试剂SABC，DAB 显色试剂盒显色，苏木素复染，自来水冲洗，脱水，透明，封片，光学显微镜观察。光镜下细胞浆有棕黄色颗粒沉着为阳性细胞。400 倍视野下，白质部位随机取3 个视野拍照，采用美国Image-Pro Plus 软件对免疫组化染色图片进行吸光度（A）测定，取均值。

2.4.2 Western blot 检测 取脑组织加RIPA 裂解混合液200 μL 冰上裂解30 min，离心取上清，BCA 法提取蛋白、测定浓度、蛋白变性。制胶、上样、电泳、转膜，封闭。分别加入一抗NgR（1∶300）、p75NTR（1∶200），4 ℃孵育8 h。加羊抗兔二抗孵育2 h（1∶5 000），洗涤，显影，曝光。Bio-Red Image Lab 5.1 软件分析各泳道条带灰度值，以β-actin 为参照，以目的蛋白灰度值/β-actin 灰度值表述目的蛋白的相对表达量。

2.5 统计学分析 采用SPSS 21.0 统计学分析，数据以（）表示。若各组样本数据符合正态分布，且符合方差齐性（采用Levene 检验方法验证），则采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q 检验，两样本均数比较采用独立样本t 检验。若各组样本数据符合正态分布，但不符合方差齐性（采用Levene 检验方法验证），则两两比较采用Dunnett’ s 检验，两样本均数比较采用独立样本t 检验。以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。若样本数据不符合正态分布，则采用非参数检验。

3 结果

3.1 一般情况观察

3.1.1 LPS 对雌鼠孕产情况的影响 造模孕鼠11 只流产，1 只死亡，其余18 只孕鼠均提前分娩，产出102 只活仔鼠，可见死产仔鼠。对照组6 只孕鼠全部足月分娩，共产出62只仔鼠，无死产仔鼠。较对照组相比，造模孕鼠产仔数量减少（P＜0.01）。见表1。

3.1.2 LPS 对新生仔鼠出生情况的影响 与对照组比较，LPS 组仔鼠出生时皮肤颜色紫暗，主动活动少，对刺激反应弱，体质量低（P＜0.01）。见表1。

表1 脂多糖对孕鼠产仔数和仔鼠出生体质量的影响（）

表1 脂多糖对孕鼠产仔数和仔鼠出生体质量的影响（）

注：与对照组比较，**P＜0.01。

3.2 LPS 对孕鼠子宫、胎盘及新生仔鼠脑组织病理学的影响 LPS 组孕鼠胎盘组织可见血管充血水肿，大量炎性细胞浸润，子宫组织可见组织结构紊乱，上皮细胞变性坏死，炎细胞浸润及充血水肿；对照组孕鼠子宫及胎盘组织未见炎性细胞及充血水肿等病理改变。与对照组比较，LPS 组孕鼠胎盘及子宫组织病理评分升高（P＜0.05）；LPS 组仔鼠脑白质区组织结构稀疏，细胞排列紊乱，结构不清，间隙增宽，组织间隙出血、水肿。对照组仔鼠脑组织结构完整，细胞排列均匀整齐，胞核较大，未见组织出血水肿，与对照组比较，LPS 组仔鼠病理评分升高（P＜0.05）。见图1、表2。

图1 LPS 对孕鼠子宫、胎盘及新生仔鼠脑组织病理学的影响（A～D，HE，×200；E～F，HE，×100）

表2 孕鼠子宫、胎盘及新生仔鼠脑组织病理学评分比较（，n=4）

表2 孕鼠子宫、胎盘及新生仔鼠脑组织病理学评分比较（，n=4）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

3.3 LPS 对新生仔鼠脑组织NgR、p75NTR 水平的影响与对照组仔鼠比较，LPS 组仔鼠脑组织中NgR、p75NTR 的表达上调（P＜0.05，P＜0.01）。见图2～3、表3～4。

表3 免疫组化法检测LPS 对仔鼠脑组织NgR、p75NTR表达的影响（，n=10）

表3 免疫组化法检测LPS 对仔鼠脑组织NgR、p75NTR表达的影响（，n=10）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

图2 脂多糖对仔鼠脑组织NgR、p75NTR 表达的影响（IHC，×400）

图3 脂多糖对仔鼠脑组织NgR、p75NTR 表达的影响

表4 脂多糖对仔鼠脑组织NgR、p75NTR 表达的影响（，n=5）

表4 脂多糖对仔鼠脑组织NgR、p75NTR 表达的影响（，n=5）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4 蒲金口服液对仔鼠脑组织NgR、p75NTR 表达的影响 与同时相模型组相比，蒲金口服液高、低剂量组及银杏叶提取物组NgR、p75NTR 的表达均减少（P＜0.05，P＜0.01）；与银杏叶提取物组相比较，高剂量蒲金口服液组NgR、p75NTR 表达下降（P＜0.05，P＜0.01）；与药物不同时相比较，高、低剂量蒲金口服液、银杏叶提取物早期干预下调NgR、p75NTR 的表达均较晚期（P ＜0.05）。见图4～6、表5～6。

图4 蒲金口服液对仔鼠脑组织NgR 表达的影响（IHC，×400）

图5 蒲金口服液对仔鼠脑组织p75NTR 表达的影响（IHC，×400）

图6 蒲金口服液对大鼠脑组织NgR、p75NTR 蛋白表达的影响

表5 蒲金口服液对仔鼠脑组织NgR、p75NTR 表达的影响（）

表5 蒲金口服液对仔鼠脑组织NgR、p75NTR 表达的影响（）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与银杏叶提取物组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与晚期组比较，＄P＜0.05，＄＄P＜0.01。

表6 蒲金口服液对大鼠脑组织NgR、p75NTR 蛋白表达的影响（）

表6 蒲金口服液对大鼠脑组织NgR、p75NTR 蛋白表达的影响（）

注：与模型组比较，*P ＜0.05；与银杏叶提取物组比较，＃P ＜0.05；与晚期组比较，＄P＜0.05。

4 讨论

早产儿脑发育不成熟，具有易损伤的特点，围产期感染、缺氧缺血等高危因素导致炎症因子大量激活、兴奋氨基酸堆积、氧自由基释放，容易发生早产儿脑病，不仅引起脑组织的损伤，还造成以后的发育障碍［20]。研究表明，宫内感染致早产脑损伤的发生不仅与炎性反应有关，同时与血管因素、胶质细胞损伤、神经损伤的修复和功能重组障碍、内源性保护机制不完善等多种因素密切相关［21]。脑神经受损后可以再生，但受损神经元所处的局部微环境及其内在特性是轴突再生失败的主要原因，外源性的抑制轴突的因子有MAIFs，胶质瘢痕，炎症等［22]。受损神经产生的MAIFs 以少突胶质细胞产生的Nogo-A、髓鞘相关糖蛋白（MAG）、OMgp 为经典代表，通过与抑制分子受体结合，激活下游信号分子RhoA，导致神经生长锥崩溃，可引起中枢神经再生失败。研究证实，NgR 是MAIFs 的高亲和力受体，在以少突胶质前体细胞系为主要成分的早产儿PVL 再生抑制机制中起关键作用［23-25]。p75NTR 是结合所有神经营养因子的TNF-α 受体超家族的成员，参与介导NgR 的跨膜信号传导，主要调节它们的促凋亡作用［26-28]。NgR、p75NTR 的表达上调，使轴突生长被抑制，阻碍神经的结构修复和功能重组。因此，检测脑组织中NgR、p75NTR 的表达，可进一步明确蒲金口服液可能的作用机制。

研究表明，大鼠童年时期发育迅速，21 日龄即相当于人类1 岁［29]，在6 周左右即可达到性成熟，而PVL 的好发时期在大鼠相当于生后第2～3 天时段，在人类则胎龄23～32 周，此时在白质部位以晚期OL 前体占主导地位，髓鞘尚未形成，细胞对免疫攻击具有高度敏感性，而晚期OLs是PVL 病变的主要靶细胞，在PVL 的发病机理中起着关键作用［30]。临床对于脑性瘫痪的诊断年龄通常为1 岁之后，近年来随着方法学的进展，可以在校正年龄5 月龄之前做出脑瘫诊断或风险预测［31]。对于本病的预防提倡早期发现、早期诊断和早期治疗，高危儿的临床干预多于生后即进行［32-34]，故实验时早期干预时间为生后至7 日龄，观察期限一般不小于14 天。采用早期干预及晚期干预是相对而言对于治疗时机的探索，以便于寻找蒲金口服液最有效的治疗时机。

本实验采用LPS 制备早产PVL 仔鼠动物模型，选用高、低剂量蒲金口服液干预，于不同时间节点进行干预，探讨蒲金口服液对宫内感染致早产脑损伤大鼠脑组织NgR、p75NTR 表达的影响。实验结果表明，孕鼠注射LPS 后，可造成宫内感染，导致胎盘及子宫组织炎性细胞浸润，组织病理学评分增高，有流产及死产现象，且产仔数少、新生仔鼠活力差，皮肤颜色紫绀，出生体质量低，仔鼠脑组织病理评分升高。通过检测仔鼠脑组织中NgR、p75NTR 表达，验证了LPS 可致仔鼠脑组织中NgR、p75NTR 的表达上调。这提示了宫内感染可促使脑组织中MAIFs 受体表达增多，推测这可能是脑损伤后促使神经再生再生失败的原因之一。药物干预后，各给药组仔鼠脑组织中NgR、p75NTR的表达均较模型组减少（P＜0.01）；各给药组之间两两比较发现，高剂量蒲金口服液作用更明显，低剂量蒲金口服液组与银杏叶提取物组之间无明显差异。推测高剂量蒲金口服液可能通过下调NgR、p75NTR 的表达，从而降低NgR、p75NTR 介导的信号通路活性，抑制下游信号转导，促进生长椎的生长，从而发挥对受损神经的保护作用。通过不同介入时点观察，发现早期干预组均较晚期干预组下调NgR、p75NTR 的表达作用明显，推测这可能与此时期大脑白质部位以晚期OL 前体占主导地位，髓鞘尚未形成，且神经系统具有可塑性有关［32]，提示了早期干预的重要性和必要性。

从中医方面来讲，血管因素所致“血瘀”为公认的致病因素，临床多采用“活血化瘀”法治疗本病。本课题组通过长期的临床实践及探索发现，“痰”同样是本病的重要致病因素，“痰”和“瘀”是宫内感染所致早产儿脑室周围白质软化的主要病理因素，其病机特点为“痰瘀阻窍，经络不通”。“痰”有有形与无形之分，瘀血阻滞气机，气运失司，水液不布，水停痰生，痰随气行，流注经络，胶着缠绵，痰瘀互阻，从而发病；针对以上病机，本课题组提出采用“化痰活瘀”的治则对早产脑损伤进行干预，这对临床治疗本病提供了新的思路。蒲金口服液是目前课题组运用中医临床思维通过辨证选药，发挥中医特色，且经过临床实践有效的经验方，具有服用简便，痛苦小的优点。本方由石菖蒲、郁金、丹参、红花四味中药组成，全方药物精炼，有活血化瘀、化痰开窍之效，实验结果说明蒲金口服液可使脑损伤仔鼠脑组织中MAIFs 受体NgR、p75NTR 表达减少，验证其治疗本病的有效性，推测宫内感染/炎症致早产脑损伤的中医病理因素主要是“痰”和“瘀”，这为活血化瘀、化痰开窍中药临床早期干预治疗本病提供了实验依据。

银杏叶提取物是目前临床使用最为广泛的中药提取物之一，现代药理研究表明，其主要含银杏黄酮、银杏内酯和白果内酯等有效成分，具有促进神经突触生长、抑制神经细胞凋亡、拮抗兴奋性氨基酸的神经毒性，清除自由基、抗脂质过氧化、扩张脑部血管、调血脂、拮抗血小板活化因子等多种药理作用［35-36]。本课题组对蒲金口服液前期的动物实验研究证实了其具有抑制OL 及其OPC 的凋亡，抑制MAIFs 的表达，及抗氧化、抑制TNF-α、IL-6 等炎症因子释放，保护受损神经细胞的作用机制，这与银杏叶提取物的药理作用机制相似。动物实验表明，银杏叶提取物能促进新生缺氧缺血性脑损大鼠脑组织Nestin 蛋白的表达，诱导神经干细胞增殖，促进神经髓鞘的形成细胞OL 表达，促进抑制神经细胞凋亡的Bcl-2 上调和caspase-3 下调，对脑缺血再灌注后的神经细胞具有显著的保护作用，促进神经损伤修复。银杏叶提取物亦可降低脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中氧化应激及炎症反应，下调TNF-α、IL-6 表达，抑制相关卷曲螺旋形成蛋白激酶（ROCK）、肌球蛋白轻链激酶（MLCK）、金属基质蛋白酶2（MMP-2）表达，减小脑梗死体积，减轻血脑屏障损伤。其不同作用机制不同程度的保护了神经系统疾病的发生及发展，减少了疾病对神经系统的损伤［37-43]。

宫内感染引起脑损伤的作用机制复杂，涉及炎性反应、血管因素、胶质细胞损伤、神经损伤的修复和功能重组障碍、内源性保护机制不完善等多种因素，但本实验仅从神经再生修复机制方面对蒲金口服液可能的作用机制做了探索，具有一定的局限性，其可能的其他方面的作用机制尚未探明，接下来课题组会进行进一步深入的研究。