丁酸梭菌早期干预对大肠杆菌攻毒肉仔鸡肠道菌群和短链脂肪酸的影响

2021-06-26舒均兰桂国弘肖明飞肖英平唐青松

饲料工业 2021年11期

■舒均兰徐娥* 桂国弘肖明飞肖英平唐青松

（1.贵州大学动物科学学院，动物营养与饲料研究所，贵州贵阳550025；2.贵州省农业职业学院，贵州贵阳551400；3.浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，浙江杭州310021）

产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）极易引起初生畜禽腹泻、肠道疾病甚至死亡，一直以来是制约畜禽健康高效养殖的重大因素。以往常用抗生素治疗或控制大肠杆菌引起的负面影响，近年随着抗生素耐药性和残留问题的日益凸显，全球限制了抗生素在畜禽业上的使用。丁酸梭菌是益生菌中重要一员，近年普遍研究表明，丁酸梭菌具有显著的抗炎、调节肠道菌群、增强免疫力等生物学功能[1-5]。此外，丁酸梭菌还可促进机体短链脂肪酸、乳酸和消化酶等物质生成，并且通过调节肠道菌群、促进免疫防御因子分泌来改善畜禽健康[6]。Yang等[7]研究表明，在饲粮中添加丁酸梭菌可降低肉鸡盲肠中大肠杆菌的数量，提高肉鸡盲肠中双歧杆菌和乳酸杆菌的数量。申露露等[8]研究表明，丁酸梭菌早期干预可降低大肠杆菌攻毒肉鸡肠道炎症因子和抗菌肽基因的表达，并降低了雏鸡的下痢。Zhang等[2]研究表明，饲粮添加丁酸梭菌可改善大肠杆菌攻毒肉鸡的生长性能、肠屏障功能和消化酶活性。然而，丁酸梭菌早期干预对大肠杆菌感染肉鸡的肠道短链脂肪酸含量的影响还未见相关报道，早期干预对肠道菌群的研究也较少。因此，本试验研究了丁酸梭菌对肉仔鸡大肠杆菌感染攻毒后肠道短链脂肪酸含量和菌群结构的变化，以期为肉鸡乃至家禽养殖生产中丁酸梭菌防治大肠杆菌病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与菌种

试验1日龄肉仔鸡为ROSS 308肉鸡，购至江苏镇江腾达孵化厂。试验用丁酸梭菌（编号：MIYAIRI II 588）购于日本米雅利桑株式会社。产肠毒素大肠杆菌K88（编号：CVCC1556）购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

1.2 试验设计

试验选取200只健康状况良好的1日龄ROSS308肉仔鸡，根据体重无差异原则随机分为2组，每组100只鸡，分别为对照组（Control组）和丁酸梭菌组（CB组）。试验开始后1～3 d，每天对Control组的仔鸡灌喂1 mL生理盐水，CB组仔鸡灌喂1 mL浓度为109CFU/mL的丁酸梭菌菌液，在第7 d时把CB组再随机分为丁酸梭菌组（CB组）和丁酸梭菌+大肠杆菌组（CB+EC组），同时将Control组也随机分成对照组（Control）和大肠杆菌组（EC组），每组50只仔鸡。EC组和CB+EC组7日龄至试验结束每天对仔鸡灌喂1 mL浓度为108CFU/mL的大肠杆菌菌液，Control组和CB组7日龄至试验结束每天对仔鸡灌喂1 mL生理盐水，试验期为14 d。试验设计和分组情况如表1所示。

表1 试验处理情况

1.3 饲养管理

试验地点为浙江省农业科学院动物试验基地。试验开始前对动物房舍、饲养设备进行检查和严格的消毒处理，动物房室内的温度利用白炽灯调节，第一周温度保持在37℃，之后每周逐渐降低2～3℃，直到与室温一致，保持24 h光照。试验肉仔鸡自由采食和自由饮水，人工投料，每天投喂3次。基础日粮组成及其营养水平见表2。

表2 基础日粮组成及营养水平（风干基础，%）

1.4 样品采集和保存

在肉仔鸡的10、14日龄时，每组随机抽取8只肉仔鸡进行屠宰，分别收集回肠和盲肠中段内容物于5 mL离心管，液氮保存，采样完毕后保存至-80℃超低温冰箱用于提取细菌DNA。

1.5 短链脂肪酸的测定

称取0.1 g的盲肠内容物于离心管中，加入9倍体积（mL）的PBS溶液混合均匀，12 000 r/min离心10 min，取上清液500μL，加入100μL的25%（质量体积比）偏磷酸巴豆酸混合液，涡旋混匀，于-20℃冰箱过夜保存24 h。上机前，12 000 r/min离心10 min取上清液于0.22μm滤膜过滤，取150μL于进样瓶，于气相色谱仪测定SCFAs含量。色谱条件为：色谱柱温度70℃；使用FID1检测器；检测温度250℃；载气为氮气；压力为37.5 kPa；氧气压力50 kPa，氢气50 kPa，灵敏度为10-1，衰减3.0。

1.6 粪便DNA提取和高通量测序分析

粪便DNA参照QIAGEN公司（QIAGEN，German）试剂盒QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit的操作步骤进行提取。并以提取的DNA为模板，引物为338F(5′ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，对细菌16SrRNA基因V3～V4区进行PCR扩增。采用双端测序法（Pair end,250 bp×2），Hiseq2500平台进行PE250测序。

1.7 数据处理与统计分析

使用Uparse软件（Uparse V7.0.1001）依据相似性≥97%将质控后的有效序列聚类成为操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）。采用QIIME（Version 1.7.0）默认参数计算各样品的alpha多样性指数（包括菌群丰度指数Ace和Chao分析，菌群多样性香农指数Shannon和辛普森指数Simpson分析以及覆盖度指数Good coverage分析）和物种分布。为了比较使用BPW增菌剂增菌不同时间的菌群结构差异，使用R软件（Version 2.15.3）内的FactoMineR软件包对样品之间的菌群结构相似度进行主坐标分析（PCoA）。短链脂肪酸和肠道菌群相对丰度的结果均使用SPSS分析，SPSS 18.0分析实验数据的显著性。结果以“平均值±标准误（Mean±SEM）”表示，P＜0.05表示有显著性差异，P＜0.01表示有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 回肠与盲肠内容物短链脂肪酸的含量

从表3可知，在肉鸡第10日龄（攻毒3 d后）和第14日龄（攻毒7 d后）的回肠中，其短链脂肪酸的含量非常少，各组间均差异不显著（P＞0.05）。

表3 丁酸梭菌对肉鸡不同天数回肠内容物短链脂肪酸含量的影响(mg/g)

由表4可知，在肉仔鸡盲肠中，10日龄时，与Control组相比，CB组中乙酸含量极显著提高（P＜0.01），EC组中的乙酸含量显著降低（P＜0.05）；CB组和CB+EC组中丁酸的含量较为相近，均极显著高于Control组和EC组（P＜0.01）。14日龄时，与Control组相比，CB组中的乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸含量均显著提高（P＜0.05），EC组中的乙酸、丙酸、丁酸显著降低（P＜0.05）。

表4 丁酸梭菌对肉鸡不同天数盲肠内容物短链脂肪酸含量的影响(mg/g)

2.2 盲肠内容物细菌高通量测序

试验第10日龄和14日龄肉仔鸡盲肠菌群结构的测定使用高通量测序技术，结果如表5所示，第10日龄和、第14日龄肉仔鸡各组分别平均获得371～405、375～651个OUT，各样品覆盖度指数（good coverage）在0.998以上。结果表明，已基本全部测出样品中序列。并且通过作出稀释性曲线图观察，如图1所示，所有样品的测序曲线趋向平坦，可说明此次测序量结果合理，并得出测序深度为63 390次。

图1 稀释曲线

表5 不同天数各组盲肠内容物16S rRNA测序结果

如图2所示，肉仔鸡盲肠第10日龄时各组均以厚壁菌门（Fimicutes）为主要门类，相对丰度占比均在90%以上，其次为变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）柔壁菌门（Tenericutes）。如图3为10日龄肉鸡盲肠属水平相对丰度，各组主要以乳酸菌属、毛螺菌科、瘤胃球菌属、丁酸球菌属、魏斯氏菌属（Weissella）、芽孢杆菌属（Bacillus）等为主要菌群。

图2 第10日龄肉鸡盲肠内容物菌群结构（在门水平上）

图3 第10日龄肉鸡盲肠内容物菌群结构（在属水平上）

肉仔鸡14日龄时，各组的菌群结构发生了变化，在门水平上（见图4），在各组主要以厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门以及蓝藻门（Cynaobacteria）为主。在属水平上，由图5显示的各菌属占比可知，乳酸菌属、瘤胃球菌属、毛螺菌科、瘤胃球菌科、柔嫩梭菌属（Faecalibacterium）、丁酸球菌属、芽孢杆菌属等为其主要的菌属。

图4 第14日龄肉鸡盲肠内容物菌群结构（在门水平上）

图5 第14日龄肉鸡盲肠内容物菌群结构（在属水平上）

表6为肉仔鸡10、14日龄时各组在属水平上，排名前八的菌群相对丰度，各组中相对丰度较大的菌属均差异不显著（P＞0.05）。在10日龄时，相对较多的为乳酸菌属、毛螺菌科、丁酸球菌属以及瘤胃球菌属4种菌属，其中CB组中瘤胃球菌属的相对丰度显著高于其他各组（P＜0.05）。14日龄时相对丰度较多的属为乳酸菌属、毛螺菌科、瘤胃球菌属以及瘤胃球菌科4种属，但均差异不显著（P＞0.05）。

表6 不同天数属水平菌群结构相对丰度（%）

图6和图7为主坐标分析（PCoA）图，利用主坐标分析这种方法，可以观察各组样品相对丰度的相似性或差异性。从图6可以看出，肉仔鸡10日龄时对Control组与其他各试验组相比，其相似性有较大差异。同时从图7可以看出，肉仔鸡14日龄时Control组、CB+EC组和另两个组相似性较小。

图6 不同样品10日龄PCoA分析

图7 不同样品14日龄PCoA分析

3 讨论

3.1 丁酸梭菌对肉鸡肠道短链脂肪酸含量的影响

肠道是动物机体最大的免疫器官，也是营养物资消化吸收的主要场所，肠道健康程度很大程度上决定了动物的生长性能和整体健康状况。短链脂肪酸是微生物代谢的一类主要产物，也称挥发性脂肪酸，主要由碳链中碳原子数小于6的乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸、戊酸、异戊酸等组成[9]。研究表明，短链脂肪酸具有供能、抗炎、免疫调节、维持肠道稳态和改善肠道菌群等重要作用[10-12]。丁酸梭菌通过在肠道中发酵纤维产生的短链脂肪酸丁酸，是机体结肠上皮细胞的主要能量物质，并通过氧化为细胞供能，增强肠道免疫和屏障功能。丁酸的代谢产物可以提高肠道对饲料中营养物质的消化、吸收，补充机体所需的营养素[13-14]。郭传珍等[15]在饲粮中添加不同剂量的丁酸钠，可增加肉仔鸡肠道短链脂肪酸浓度。这与本试验相似，本试验中直接使用现配制的含有丁酸梭菌活菌的培养液，在肠道厌氧的环境下继续发酵增殖，代谢产生丁酸，检测结果显示出灌喂丁酸梭菌提高了盲肠乙酸、丁酸、异丁酸的含量，并且随着灌喂的时间推迟，呈现出盲肠短链脂肪酸增加的趋势。此外，大肠杆菌会导致乙酸含量降低，这提示丁酸梭菌一定程度上可抑制大肠杆菌降低盲肠短链脂肪酸含量。

3.2 丁酸梭菌对肉鸡肠道菌群结构的影响

丁酸梭菌是一类重要的益生菌，进入动物肠道可促进肠道有益菌的生长，抑制有害菌的增殖[16]。肠道菌群为动物宿主提供额外的代谢功能，包括营养的消化吸收、膳食纤维的发酵利用和某些微生物的合成等。肠道菌群与家禽生长发育密切相关，并参与肠道免疫调控[17]。刘亭婷等[18]研究表明丁酸梭菌促进蛋用仔公鸡乳酸杆菌和双歧杆菌等的益生菌的增殖，并抑制大肠杆菌的生长。Yang等[7]研究表明，丁酸梭菌有益于肉鸡肠道菌群的平衡。Zhang[1]等报道，丁酸梭菌降低了大肠杆菌K88攻毒肉鸡盲肠大肠杆菌和产气荚膜梭状芽孢杆菌的数量，并提高了双歧杆菌数量，改善了肠道微生物区系。Huang等[19]研究表明，饲粮添加丁酸梭菌，降低了坏死性肠炎的东北鸡肠道产气荚膜梭菌的丰度。此外，多方研究报道了丁酸梭菌可调节肠道菌群平衡[20-23]。本试验通过细菌高通量测序发现，肉仔鸡盲肠主要以厚壁菌门、变型菌门和拟杆菌门为主，这与前人[24]研究结果一致。在属水平上，各组间均以乳酸菌属、毛螺菌科、瘤胃球菌属、瘤胃球菌科、丁酸球菌属等为其优势菌群，其中灌胃了丁酸梭菌的肉仔鸡试验组中瘤胃球菌属的相对丰度显著增加，乳酸菌属的相对丰度仍然保持着较高的水平。有研究表明，瘤胃球菌科能够产生碳水化合物降解酶，其中瘤胃球菌属能够分泌大量的纤维素酶和半纤维素酶，混合发酵产生乙酸；毛螺菌科中的多个菌属能够发酵纤维代谢产生丁酸[25-26]。以此为肠道提供浓度较高的酸环境，降低肠道pH，改善肠道结构。结果提示，丁酸梭菌早期干预可改善大肠杆菌攻毒肉鸡的肠道菌群结构。