蟾酥壳聚糖微球的制备及体外释药性研究

2021-06-25李宗云何世学张春宝

中国医药导报 2021年13期

刘莉李宗云何世学赵越张春宝

1.河北省衡水市人民医院制剂科，河北衡水 053000；2.河北省衡水市人民医院临床药学科，河北衡水 053000

中华大蟾酥或黑框蟾蜍的干燥分泌物为蟾酥[1-2]，临床用于调控血压[3]、调节免疫力[4]、抗肿瘤等[5-6]。蟾酥作为中药制剂的常用药物，包括脂溶性成分和水溶性成分。5-羟色胺和蟾蜍色胺是主要的水溶性成分[7]，脂溶性成分为蟾毒内酯类[8-9]。酯蟾毒配基及华蟾酥毒基为蟾毒内酯的主要成分[10]，因蟾酥配基具有毒性，在临床上应用时常有中毒及过敏的报道，限制了其应用。缓控释制剂不仅能更快地达到稳态血药浓度、降低给药次数，而且能够给含毒性的中药制剂在临床使用上提供不同的研究方向[11]。查阅文献发现鲜有把蟾酥制成壳聚糖微球这种新剂型的相关研究，因此本文对蟾酥壳聚糖微球进行研究，并对微球内的水溶性及脂溶性成分进行了相关研究。

微球有增加稳定性、提高生物利用率等特点[12-13]。本研究把脱乙酰壳聚糖作为载体，通过乳化-交联法来制作蟾酥壳聚糖微球，并观察研究其在体外的释药特性。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260 高效液相色谱仪(美国Agilent 公司，可变波长紫外检测器)；SQP 电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，精密度：0.01 mg]；KDC-1042 低速离心机(科大创新股份有限公司)；激光粒度分析仪(欧美克科技有限公司)；RCZ-8AA 智能药物溶出仪(天津大学精密仪器厂)；UV-2700 紫外分光光度计(岛津)。

1.2 药物与试剂

脱乙酰壳聚糖(脱乙酰度＞90%，玉环县海洋生物化学有限公司)；蟾酥(河北康博药业有限公司，20150521，经河北省衡水市人民医院中医科肖红主任鉴定为蟾酥饮片)；华蟾酥毒基对照品(中国食品药品检定研究院，110803～200505，纯度≥99.6%)；酯蟾毒配基对照品(中国食品药品检定研究院，7189306，纯度≥98%)；5-羟色胺对照品(中国食品药品检定研究院，10015～201706，纯度≥98%)；三氯甲烷(莱阳市精细化工厂，20180310)；丙酮(烟台远东精细化工厂，20180901)；正丁醇(天津市恒兴化学试剂精造有限公司，20181006)；乙腈(美国fisher chemicals，08412，色谱纯)；水为高纯水。

2 方法与结果

2.1 蟾酥壳聚糖的制备

2.1.1 处方水相：1%醋酸、1%脱乙酰壳聚糖、蟾酥；油相：液体石蜡；乳化剂：司盘60；固化剂：戊二醛。

2.1.2 制备方法取壳聚糖1.00 g 溶于99 mL 水中，搅拌均匀，搅拌的同时加入1 mL 冰醋酸，混匀，备用。0.20 g 蟾酥加20 mL 乙醇使溶解，将上述两种液体混匀。放置过夜，静止消泡，备用[14-16]。取1.00 g 司盘60加200 mL 液体石蜡，搅拌使其混合均匀。将水相加入油相中，搅拌1 h，搅拌同时加入12 mL 戊二醛，3 h，使固化，高倍显微镜下观察没有粘连现象。低速离心机下离心10 min，转速3000 r/min，离心半径13 cm，取下层，经石油醚多次洗涤后，80℃真空干燥箱干燥24 h，收集得到微球。

2.2 鉴别

2.2.1 蟾毒内酯类成分取相当于0.20 g 的微球，加10 mL 乙醇，加热回流30 min，放冷，过滤，滤液置于10 mL 量瓶，乙醇稀释至刻度，为供试品溶液。精密称取酯蟾毒配基、华蟾酥毒基对照品，稀释成浓度为1 mg/mL 的溶液，为对照品溶液。吸取供试品、对照品液各8 μL，点于同一硅胶G 板，环己烷-三氯甲烷-丙酮(4∶3∶3)展开剂中展开，取出，晾干，喷以10 %硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。结果供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上，均有2 个斑点且阴性没有干扰，见图1A(封三)。

图1 蟾酥壳聚糖微球的薄层鉴别(见内文第32 页)

2.2.2 蟾毒色胺类成分取相当于0.20 g 的微球，加50 mL 水，煎煮3 次，每次1 h，滤过，合并滤液置于100 mL 量瓶中，加水稀至刻度，摇匀，为供试品溶液。吸取供试品、对照品液各8 μL，点于同一硅胶G 板，正丁醇-醋酸-水(4∶1∶5)展开剂中展开，取出，晾干，喷以20%对二甲氨基苯甲醛盐酸溶液，加热至斑点显色清晰。结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点且阴性没有干扰，见图1B(封三)。

2.3 含量测定方法

2.3.1 色谱条件与适用性试验 Diamonsil(C185 μm，250 mm×4.6 mm)，流动相：乙腈-0.5%磷酸二氢钾(52∶48)，磷酸调pH 为3.0，检测波长：296 nm，流速：1.00 mL/min，柱温：40℃；进样：10 μL[17-19]。见图2。

图2 高效液相色谱图

2.3.2 对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的华蟾酥毒基对照品1.00 mg、酯蟾毒配基对照品0.90 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，浓度分别为100、90 μg/mL，备用。

2.3.3 供试品溶液的制备取0.25 g 微球，置于圆底烧瓶中，加25 mL 甲醇，称重。加热回流1 h，放冷，再次称重，差值用甲醇补足，取续滤液，即得。

2.3.4 线性关系考察标准曲线绘制：分别精密量取华蟾酥毒基或酯蟾毒配基对照品溶液0.10、0.50、1.00、1.50、3.00、5.00 mL，置5 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，取10 μL，高效液相色谱进行测定。横坐标为对照品溶液浓度(μg/mL)，纵坐标为峰面积，绘制标准曲线，回归方程：华蟾酥毒基Y=7367.4X+4026(r=0.9998)，表明在0.02～1.00 μg 内有很好的线性关系；酯蟾毒配基Y=10865X+7175.5(r=0.9997)，表明在0.018～0.900 μg内有很好线性关系。

2.3.5 精密度试验取“2.3.2”对照品溶液10 μL，均进样6 次，按“2.3.1”的色谱条件进行测定，考察精密度。华蟾酥毒基及酯蟾毒配基的相对标准偏差(RSD)分别为0.18%和0.27%。

2.3.6 稳定性实验将浓度分别为5 μg/mL 华蟾酥毒基、18 μg/mL 酯蟾毒配基的溶液，按“2.3.1”条件于0、2、4、6、12、18、24 h 进样10 μL，华蟾酥毒基及酯蟾毒配基RSD 分别为0.44%和0.65%，表明在24 h 内稳定。

2.3.7 重复性试验“2.3.6”相同浓度对照品溶液均取6 份，按“2.3.1”进行测定。华蟾酥毒基及酯蟾毒配基RSD 分别为2.65%和2.35%，说明该方法有很好的重现性。

2.3.8 加样回收率试验取已知含量的蟾酥粉末10.6 mg，精密称定9 份，另分别加入相当于含量为80%、100%、120%华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对照品溶液，按“2.3.1”进行测定。求得华蟾酥毒基平均加样回收率为98.21%，酯蟾毒配基平均加样回收率为97.18%。均得到很好的回收率，可以作为含量测定。见表1～2。

表1 华蟾酥毒基加样回收率结果

表2 酯蟾毒配基加样回收率结果

2.4 微球形态及粒径考察

光学显微镜观察其形态，用激光粒度分析仪测量其粒径，平均粒径为9.20 μm。

2.5 蟾毒内酯类含量测定

称取3 批0.10 g 微球，置于圆底烧瓶中，加50 mL甲醇，称重。回流加热1 h，放冷，再次称重，差值用甲醇补足，滤过，取1 mL 续滤液置于20 mL 量瓶中，定容，为供试品溶液，制作3 份按上述高效液相色谱条件进行检测，测得总载药量平均值为6.06 mg/g。见表3。

表3 蟾毒内酯类成分的载药量(mg/g，n=3)

2.6 包封率测定

精密称取蟾酥壳聚糖微球25 mg，加入10 mL 甲醇，超声提取，放置过夜后将微球研磨，3000 r/min 离心5 min，取上清液置于10 mL 容量瓶中定容，过微孔滤膜，10 μL 进样测定含量，计算包封率[20]，微球的平均包封率为73.30%。见表4。

表4 包封率测定结果(n=3)

2.7 吲哚生物碱类含量测定

取微球0.10 g，置入圆底烧瓶中，加50 倍水，回流加热1 h，提取3 次，冷却，过滤，取续滤液，倒入100 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度作为供试品溶液[21-22]。制作3 份在波长556 nm 处测定吸光度，平均含量为6.59 mg/g。见表5。

表5 吲哚生物碱类含量(n=3)

2.8 体外溶出度

依据2020 版药典[23]，采用浆法测定释放度，溶出介质为人工胃液和人工肠液[24]。取蟾酥微球和蟾酥原料药，入透析袋，置于不同的溶出杯中。温度：(37.0±0.1)℃，转速：(100±1)r/min，介质量：1000 mL，分别在20、60、120、180、240、300、360、420、480、540、600 min 时取1 mL，过膜，差值采用人工胃液或人工肠液进行补足，直到达到平衡，见图3。释放度实验说明：与蟾酥原料药比较，蟾酥壳聚糖微球具有很好的缓释效果。