萆祛风饮用于湿热蕴结证痛风性关节炎大鼠的疗效及机制研究

丘青中 戚子荣 邢振龙

1.广东省中西医结合医院关节与创伤骨科，广东佛山 528200；2.广东省中西医结合医院手足外科，广东佛山 528200

痛风是由于人体内嘌呤代谢失常，引起体内尿酸(UA)水平升高，尿酸盐晶体在体内累积引发急性关节部位的红肿热痛为主要症状的一种关节及软组织炎症性疾病[1]，如果不及时治疗与干预，可以发展为痛风石、泌尿系结石及痛风性肾病[2]。随着目前经济发展及生活水平的提高，饮食习惯的改变，痛风的发病率不断升高，且愈加趋向年轻化，逐渐成为危害国民健康的一种常见代谢性疾病。目前药物治疗主要是以非甾体抗炎药和秋水仙碱为主，但因其有胃肠道不良反应，临床上不易长期口服[3]。中医对痛风的认识久远，中医药治疗痛风效果良好，患者服用后较少出现药物不良反应。广东省佛山市名中医丘青中教授师承国医大师石仰山，一直致力于传承与发展中医骨伤科，在30 多年的临床实践中积累了丰富的治疗痛风的经验，根据多年的临床实践经验总结出经验方萆薢祛风饮[4]，主要治疗湿热蕴结证痛风性关节炎急性发作，本研究采用Mc Carty DJ[5]经典造模方法与湿热蕴结证造模方法[6]，使用微晶型尿酸钠诱导湿热蕴结证大鼠痛风性关节炎模型，初步探索萆薢祛风饮对急性痛风性关节炎的作用机制，为临床应用及推广提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级健康SD 大鼠50 只，雄性，6～8 周龄，体重(250±20)g，广州中医药大学动物实验中心代购，实验场地：广州中医药大学动物实验中心。实验动物使用许可证号：syxk(粤)2016-0023，实验动物合格证号：44203400011123。实验动物至少饲养1 周后使用，饲养环境为温度(22±1)℃，湿度(55±5)%，12 h 光暗循环，饲料和水均在消毒后由动物自由摄取。已通过广东省中西医结合医院(以下简称“我院”)伦理审查，严格按照实验动物有关条例进行。

1.2 仪器与试药

1.2.1 药剂

秋水仙碱片(云南西双版纳版纳药业有限责任公司，批号：190217)，0.5 mg/片，以蒸馏水稀释至浓度为0.003 mg/mL 秋水仙碱溶液备用；尿酸钠结晶(美国Sigma 公司，批号：BCBH6934Y)；萆薢祛风饮：萆薢30 g、土茯苓20 g、薏苡仁20 g、车前草15 g、蒲公英15 g、山慈菇20 g、忍冬藤20 g、地龙15 g、赤小豆12 g、赤芍12 g、川牛膝12 g。药物购自我院药房。煎煮方法：以上药物适当磨碎后，放入煮药锅用3 倍量水浸泡30 min 后，用文火煎煮约2 h，等水量浓缩至1 倍药物体积为止，然后将经过滤出的药汁通过80%乙醇回流萃取，回流重复3 次取得药液提取液，使用定性滤纸过滤，最后以恒温60℃水浴蒸干，所得的药液蒸干提取物置于冰箱存储。

1.2.2 仪器

电热恒温水浴锅(浙江宁波医疗器械厂，SK12-6)；精密电子天平(德国赛多利斯公司，BSA124S 型，感量：0.1 mg)；酶联免疫吸附试验检测试剂盒(USA Sigma公司，批号：DSM2000)；大鼠半胱氨酸天冬氨酸酶(Caspase-1)抗体(上海碧云天生物科技有限公司，批号：AF2165)；台式高速冷冻离心机(日本Hitachi 公司，CR-GⅡ)；全自动生化仪(日本日立，7150 型)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组

50 只大鼠采用随机数字表法分为空白对照组、模型组、秋水仙碱组、高剂量萆薢祛风饮组、低剂量萆薢祛风饮组，每组各10 只。

1.3.2 造模

1.3.2.1 湿热蕴结证造模方法 空白对照组在正常环境下饲养15 d，其他四组在正常饲养基础上，饮食上加入200 g/L 蜂蜜水自由饮用，且隔日按大鼠体重灌服猪油脂10 g/kg，共10 d，然后放入温度为(32±2)℃，相对湿度为95%的人工气候箱中饲养，造模时间共15 d。观察大鼠，当出现肛温升高、倦怠、嗜卧，大便偏稀等症状时，提示大鼠湿热蕴结证造模成功[7]。

1.3.2.2 痛风性关节炎造模方法 湿热蕴结证造模结束后，四组均以10%水合氯醛对大鼠行腹腔注射麻醉(按0.3 mL/100 g)，麻醉后取仰卧位固定。关节腔内注射：部位选取大鼠右侧踝关节后侧[8-10]，采用注射针以30°～40°方向插入至跟腱内侧进行注射。四组则均向右侧踝关节内注入0.2 mL 尿酸钠溶液，空白对照组向右侧踝关节内注入0.2 mL 生理盐水。造模大鼠出现右侧踝关节明显肿胀，大鼠踝关节红肿热痛，关节屈伸不利，甚至出现三足着地的现象，提示大鼠急性痛风性关节炎造模成功[7]。

1.3.3 给药

采用灌胃给药方式，高、低剂量萆薢祛风饮组按大鼠与成人用药量比进行换算，给予萆薢祛风饮药液提取物(剂量分别为8.31、4.52 g/kg)，秋水仙碱组给予秋水仙碱溶液(按9 mg/kg)[11]，模型组和空白对照组给予等体积生理盐水。均为1 次/d，连续7 d。

1.4 观察指标

①大鼠关节肿胀程度：通过2 cm 试纸配合游标卡尺，分别在痛风性关节炎造模前1 h、造模后2 h 测量并记录大鼠右侧踝关节周径，造模前1 h 数据为关节初始周径，造模后2 h 数据为关节肿胀后周径，关节肿胀程度(%)=(关节肿胀后周径－初始周径)/初始周径×100%，计算并记录肿胀程度，其分数与肿胀程度成正比。②血清中UA、白细胞介素(IL)-1β、Caspase-1 水平测定：在第7 天灌胃2 h 后股动脉取血，3000 r/min(离心半径=24 cm)离心15 min，取上清液，采用全自动生化分析仪测定UA 水平，用试剂盒检测IL-1β 及Caspase-1 水平。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计学软件对所得数据进行分析，计量资料采用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t 检验，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠关节肿胀程度比较

高剂量萆薢祛风饮组关节肿胀度低于模型组，差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠关节肿胀程度比较(%，±s)

表1 各组大鼠关节肿胀程度比较(%，±s)

注：与模型组比较，△P ＜0.05

2.2 各组大鼠血清中UA、血清IL-1β、Caspase-1 水平比较

与空白对照组比较，模型组血清中UA、IL-1β、Caspase-1 水平明显升高，差异均有统计学意义(均P ＜0.05)。与模型组比较，高剂量萆薢祛风饮组血清中UA、IL-1β、Caspase-1 水平降低，低剂量萆薢祛风饮组血清中UA 水平降低，差异均有统计学意义(均P ＜0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清中UA、IL-1β、Caspase-1 水平比较(±s)

表2 各组大鼠血清中UA、IL-1β、Caspase-1 水平比较(±s)

注：与空白对照组比较，*P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05。UA：尿酸；IL-1β：白细胞介素1β；Caspase-1：半胱氨酸天冬氨酸酶

3 讨论

痛风性关节炎急性发作时会激活体内炎症细胞因子[12-13]，因此，通过抑制炎症的连锁反应成为缓解痛风性关节炎症状的一个作用靶点。在炎症发展的早期，关节局部温度是正常的，体内的血液中的UA 水平升高之后，原沉积在关节附近的结缔组织部位的尿酸盐晶体波动脱落。当尿酸盐晶体的黏附性达到一定临界值，其开始进入关节腔内并扩散，同时机体的炎症反应控制机制随着尿酸盐晶体与免疫球蛋白的结合而得到激活，从而使炎症局部的吞噬细胞聚集升高[14-17]。环氧化酶和脂氧化酶在两者的激活下，使前列腺素及其他致炎物质[如IL、肿瘤坏死因子(TNF)]等得到促进转化，炎症的发展出现链式反应。但炎症进展到一定时期，部分血清因子的生成(如脂蛋白β-100、某些酶类)，联合前列腺素的共同作用，达到影响甚至抑制机体炎症的效果，使之进入缓解期[18]。综上而言，痛风性关节炎占据了炎症的整个始发终末，包括炎症早期诱导、进展及自发消退的3 个基本过程。

通过本研究数据可以看出，模型组关节肿胀程度较高，UA、IL-1β、Caspase-1 水平均较空白对照组明显升高，从侧面提示了急性痛风性关节炎激活了体内炎症因子及炎症反应，截断该连锁反应的启动或继发过程可能是治疗痛风性关节炎的靶点之一。本研究显示，与模型组比较，高剂量萆薢祛风饮组在缓解痛风性关节炎的关节肿胀方面均可起到良好的效果，但是低剂量萆薢祛风饮组无明显疗效，不仅提示萆薢祛风饮对急性肿胀症状的治疗作用，还提示了其缓解肿胀症状需要达到一定的有效药物浓度。在临床实践中，可以考虑在痛风性关节炎急性发作期关节红肿热痛明显时使用萆薢祛风饮进行辅助治疗。关节肿痛症状作为局部炎症反应在关节部位的外在表现，萆薢祛风饮可能是通过抑制炎症反应的进展及继发机制发挥作用。与模型组比较，高剂量萆薢祛风饮组IL-1β、Caspase-1 水平降低，差异有统计学意义(P ＜0.05)，提示达到有效浓度的萆薢祛风饮可以通过对IL-1β、Caspase-1 的调节干扰炎症的进展。在调控机体内UA水平方面，高剂量和低剂量萆薢祛风饮组与模型组比较均有大幅度下降，差异均有统计学意义(均P ＜0.05)，考虑萆薢祛风饮可降低大鼠体内的UA 水平，但是具体作用机制为促进UA 排泄还是减少UA 的生成途径尚不明确，需要结合对大鼠的尿液UA 进行UA 测定方能进行下一步推测。

在治疗方面，西医的主流观点及指南建议为在急性期，使用抗炎药物缓解急性症状，并可以使用小剂量秋水仙碱预防痛风再次发作[19]。非急性期可以使用促进UA 排泄或者减少UA 生成的药物来降低体内UA 的浓度，避免尿酸盐结晶在人体关节沉积为痛风石。中医药因为临床疗效及副作用少，不失为防治痛风性关节的另一思路。广东省佛山市名中医丘青中教授认为痛风的病因为体内湿热为底，在外感、受寒、湿着或汗出当风等因素下，内热外寒相搏，瘀滞于关节，故关节

温高作痛[19-23]。湿浊热毒内蕴是机体内部的基础[24-25]，外感邪毒阻滞筋脉骨节为急性发作的病机，针对此病因病机，以“祛风除湿、清泻蕴热”为治则拟临床经验方萆薢祛风饮：萆薢、土茯苓、薏苡仁、车前草、蒲公英、山慈菇、赤芍、忍冬藤、地龙、赤小豆、川牛膝。该方可以祛风为逐人体肌表经络所受之风寒湿邪，除湿泻热为驱四肢郁久之湿浊热毒，从而使筋脉骨节屈伸滑利[26]。丘青中教授在临床上广泛运用此方，取得良好疗效，且其安全性高，较之西药，中药更易让患者接受，且其标本兼治，虚实并调，真正能解除患者痛苦，降低发病率。

综上所述，萆薢祛风饮可通过抑制IL-1β、Caspase-1介导的系列炎症连锁反应，缓解痛风发作的关节肿胀症状，从而对痛风性关节炎急性发作起到治疗作用。本研究对抗炎作用与降UA 的具体机制尚未深入研究，剂量仅分为高低剂量，后续可通过加大调整药物剂量幅度进一步探寻量效关系与最佳药物浓度，以及进一步完善萆薢祛风饮对大鼠痛风性关节炎炎症反应抑制的影响[24，27]，进一步研究萆薢祛风饮对湿热蕴结证痛风性关节炎抗炎作用的机制具有重要的现实意义。