端粒酶基因多态性与乳腺癌化疗耐药性的关联研究

赵庆丽，曾潮宁，张锋军

（1.中国人民解放军联勤保障部队第九四○医院，甘肃 兰州 730050；2.兰州雅华生物技术有限公司，甘肃 兰州 730050）

端粒酶是一种能延长端粒末端的反转录DNA合成酶，主要由人端粒酶RNA（hTR）、端粒酶相关蛋白（TEP1）、人端粒酶催化亚单位（hTRT）3部分组成[1]。近年来许多研究都已证实端粒酶与肿瘤之间的相关性，如TERT基因的rs2853669（-245T＞C）位点不仅与肺癌患病风险的增加有关，还可有效降低乳腺癌的患病风险[2]；TERC基因rs10936599位点的C等位基因与TERT基因rs10069690位点的T等位基因都与肺癌的患病风险增加相关[3]；TERC基因的rs35073794和TERT基因的rs10069690位点与肾细胞癌的患病风险相关[4]。端粒在耐药性中的作用目前尚不清楚，大多数研究主要集中在端粒酶活性和端粒长度上，但这些发现仍然存在争议。已发现由抗癌药物或辐射诱导的DNA双链断裂会增加TRF2的表达，它可作为DNA损伤的早期指标，可抑制ATM依赖性DNA损伤应答网络的活化，表明TRF2可能是一种DNA修复因子而不仅仅是端粒结合因子。在耐药细胞中若通过RNA干扰抑制TRF2表达，可逆转它的抗性表型，表明TRF2在DNA损伤应答中起重要作用，并参与胃癌的耐药性[5]。Deschatrette等[6]在培养肝癌细胞对甲氨蝶呤（MTX）和顺铂耐药性的研究中发现，肿瘤细胞对抗癌药物的耐药性可能是间歇性的，并且耐药性的出现由端粒的长度决定。Zhang等[7]研究发现，在不依赖端粒酶逆转录酶活性的情况下，TERT可通过减少骨肉瘤细胞内的ROS来抑制顺铂所诱导的细胞凋亡，以此来对抗耐药性的产生。

目前，大多数研究认为某些药物（如多柔比星、顺铂或5-氟尿嘧啶）敏感性增加与癌细胞中端粒酶的表达下降或活性抑制相关。然而，由端粒酶改变所引起的抵抗机制仍然是一大难题。有研究认为，它可能与端粒缩短、基因组不稳定、hTERT易位、线粒体功能调节甚至ABC家族基因表达改变有关[8]。目前对于端粒酶在乳腺癌耐药中的研究较少，本文通过对乳腺癌化疗耐药性与端粒酶基因上SNP（多态性）关联的研究，以期为临床个体化用药提供基础数据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究选取的234例样本来自2013年9月至2017年4月期间在我院住院的患者。所有样本都经临床确诊并接受过以蒽环类药物为基础的化疗方案治疗至少2次，所有样本信息完整。本研究采集的所有样本及收集的临床资料均获得本人或其法定监护人的知情同意并签署知情同意书，获兰州大学基础医学院伦理委员会批准。依据国际卫生组织确定的实体瘤疗效评价标准将化疗疗效评价分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、疾病稳定（SD）和疾病进展（PD）。根据以上标准综合评价后，本研究将CR和PR归为敏感组，SD和PD归为耐药组。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取 严格按照血液基因组DNA非柱式提取试剂盒（北京天根）的说明书进行外周血基因组DNA的提取，采用NanoDrop 2000分光光度计进行DNA浓度的测定。

1.2.2 端粒酶相关基因多态性位点的选择 通过查阅文献确定与耐药发生可能相关的端粒酶基因，通过使用Hapmap、1000 Genomes及Ensembl数据库对这些基因上的SNP位点进行筛选，筛选出可能与乳腺癌耐药相关的SNP位点。

1.2.3 SNP基因检测与分型 SNP位点的基因分型使用质谱芯片法，根据SNP位点设计引物，以该SNP位点为中心选取长度在100 bp以上的一段基因，应用Assay Design 3.1软件（Sequenom公司，美国）设计反应所需要的引物，所用引物序列见表1。此步骤由北京博淼生物科技有限公司完成。

表1 SNP位点PCR扩增引物序列

1.2.4 Hardy-Weinberg平衡检测 对各位点的等位基因频率进行Hardy-Weinberg平衡检测，由χ2检验确定差异是否具有统计学意义。对不符合Hardy-Weinberg平衡的位点予以排除，不进行后续的统计分析。

1.2.5 SNP位点连锁不平衡分析和单体型分析 采用Haplowiev 4.2软件进行单体型分析，在分析单体型时，若构建的单体型在样本中的频率小于3%，则在分析时予以排除。用SHE sis软件进行连锁不平衡分析，计算连锁不平衡指数D'，若D'=0，说明完全无连锁不平衡；若0＜D'＜0.3，不存在连锁不平衡；若0.3≤D'＜0.5，存在轻度连锁不平衡；若 0.5≤D'＜0.8，存在中度连锁不平衡；若0.8≤D'＜1，则存在强连锁不平衡；若D'=1，为完全连锁不平衡。

1.2.6 统计分析 临床资料和分型结果运用SPSS 22.0软件，使用χ2检验、Fisher's精确检验（当样本量＜5时）进行各位点结果分析，计算P值，P＜0.05则认为差异有统计学意义。

1.3 评价端粒酶与化疗耐药性相关联的指标

比较敏感组与耐药组TEP1、TERT和TERC的基因型分布和等位基因频率。基因型和等位基因相对风险度通过计算比值比（OR）和相应的95%置信区间（95%CI）进行评估。

2 结果

2.1 临床样本特征分析

对乳腺癌化疗样本的基本信息进行统计学分析，结果见表2。样本总人数234人，其中敏感组157人，占67.1%；耐药组77人，占32.9%。两组在年龄、绝经状态、临床分期、肿瘤大小、淋巴结分期、ER、C-erbB-2 的分布上都无统计学差异（P＞0.05）；但在组织学类型、PR及分子分型上两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 入选患者的临床特征

2.2 SNP等位基因质谱分型结果

TEP1基因rs2678685位点具有G和T 2种等位基因，TT、GT、GG 3种基因型；rs1713449位点具有C和T 2种等位基因，CC、TC、TT 3种基因型；rs1760897位点具有A和G 2种等位基因，AA、AG、GG 3种基因型；rs872072位点具有G和A 2种等位基因，GG、GA、AA 3种基因型；rs938886位点具有G和C 2种等位基因，GG、GC、CC 3种基因型。TERT基因rs33954691、rs2735940位点都具有G和A 2种等位基因，GG、GA、AA 3种基因型。TERC基因rs2293607位点具有T和C 2种等位基因，TT、CT、CC 3 种基因型。

2.3 Hardy-Weinberg平衡检测

敏感组TEP1基因rs2678685、rs1713449、rs1760897位点基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡检测，χ2分别为0.814、0.098、0.266，P值均大于0.05。耐药组TEP1基因rs2678685、rs1713449、rs872072、rs938886位点基因型频率符合 Hardy-Weinberg 平衡检测，χ2分别为 0.478、0.257、0.309、0.249，P 值均大于0.05。敏感组与耐药组TERT基因rs33954691、rs2735940位点基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡检测，敏感组TERT 基因 rs33954691、rs2735940 位点 χ2分别为 0.067、0.241；耐药组 TERT基因 rs33954691、rs2735940位点 χ2分别为0.202、0.938，P值均大于0.05。敏感组与耐药组TERC基因rs2293607位点基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡检测，敏感组与耐药组χ2分别为0.801、0.257，P值均大于0.05。

2.4 SNP位点与乳腺癌化疗敏感性的关联分析

对乳腺癌化疗患者端粒酶基因TEP1、TERT、TERC上的多态性位点基因分型结果进行统计分析，结果见表3。结果显示：TERT基因上的rs33954691位点在敏感组中的GG、AG、AA基因型数量及频率分别为 101（64.3%）、45（28.7%）、11（7.0%）；在耐药组中3种基因型数量及频率分别为 37（48.1%）、36（46.8%）、4（5.2%）。与野生型基因GG相比，AG基因型在敏感组和耐药组之间的分布有显著差异（P=0.008，OR=0.458，95%CI=0.257～0.816），AA基因型在敏感组和耐药组之间的分布无显著差异（P=1.000，OR=1.007，95%CI=0.302～3.361）。在敏感组和耐药组中A等位基因与野生G等位基因相比差异无统计学意义（P=0.084，OR=1.475，95%CI=0.948～2.294）。其他基因位点在敏感组和耐药组中无显著差异（P＞0.05）。

表3 端粒酶基因多态性位点在敏感组和耐药组的基因型和等位基因频率[n（%）]

2.5 端粒酶TEP1基因连锁不平衡分析和单体型分析

由于TERC、TERT只有1个或2个位点，无法做连锁和单体型分析，而 TEP1 基因的 rs1713449、rs872072、rs2678685、rs1760897、rs938886位点都位于14号染色体，在上述相关性分析的基础上对这5个位点进行连锁不平衡分析。结果显示：rs938886与rs1713449（D'=0.924）之间存在强连锁不平衡；rs1760897与rs2678685（D'=0.630）之间存在中度连锁不平衡；rs938886 与 rs872072（D'=0.383）和 rs872072 与 rs1713449（D'=0.389）之间存在轻度连锁不平衡。对这5个位点进行单体型分析，结果见表4。结果显示：G CAAG、TTGGC这两种单体型在敏感组和耐药组中的差异具有统计学意义（P=0.002，OR=3.348，95%CI=1.487～7.540；P=0.012，OR=4.491，95%CI=1.246～16.182），并且为一种危险因素，携带这两种单体型的患者使用化疗药物时发生耐药的风险会分别增高3.3、4.5倍。

表4 乳腺癌患者TEP1基因单体型分析

3 讨论

3.1 端粒酶基因TERT的rs2735940位点与乳腺癌的患病风险无相关性

尽管很多乳腺癌患者在术前应用化疗药物后，肿瘤的体积缩小，但临床治疗过程中还是会出现疗效不佳的情况，主要原因往往是在治疗过程中出现了耐药情况。目前对于肿瘤在化疗过程中出现耐药机制的研究很多，但由于肿瘤细胞耐药的机制极其复杂，不仅与肿瘤的病理类型、临床分期等有关，还与个体的遗传因素相关。目前许多研究认为，端粒长度可作为癌症风险的生物标志物。几项病例对照研究发现，较短的端粒与癌症如膀胱、食管、胃、头颈部、肺、卵巢和肾脏等相关[9-10]。虽然乳腺癌中对端粒长度的关联研究结果不一致，但大多数研究支持长的端粒与乳腺癌的风险相关。此外还有研究证实，编码端粒相关蛋白基因中的单核苷酸多态性（SNPs）可以通过影响端粒中的基因表达或蛋白质构造来影响端粒长度和染色体稳定性。在土耳其和伊朗东南部关于端粒酶TERT基因rs2735940位点与乳腺癌相关性的研究中，未发现该位点与乳腺癌的患病风险相关[11-12]，这与我们的研究结果一致。但另一项研究通过对TERT基因多态性与乳腺癌相关性进行系统评价分析发现，虽然rs2735940与乳腺癌无相关性，但对激素受体表达情况分析后发现，rs2735940位点与ER-/PR-的乳腺癌患者之间具有相关性。表明在乳腺癌中该关联可能受激素受体状态和遗传修饰的双重调节。

3.2 端粒酶基因TERT的rs33954691位点AG基因型与乳腺癌化疗敏感性相关

目前许多研究发现了端粒酶、端粒长度在耐药发生过程中发挥了作用。许多研究证实了化疗药物如阿霉素、顺铂、5-氟尿嘧啶等耐药的发生与端粒的长度及端粒酶活性的改变相关[7-8]。在我们的研究中，目前仅发现端粒酶基因TERT上的rs33954691位点AG基因型与乳腺癌化疗敏感性显著相关，并未发现rs2735940与乳腺癌化疗敏感性之间的关联。可能是由于我们选择的样本激素水平有一定的偏差，尤其是PR，在临床资料统计分析中，PR在敏感组和耐药组中的分布差异有统计学意义（P＜0.05），这有可能是造成rs2735940与乳腺癌化疗敏感性之间关联不存在的原因。根据我们的结果及之前的一些研究推测，端粒酶基因TERT上的rs33954691位点的多态性可能会影响人群中端粒酶活性发挥正常功能，进而影响了端粒的长度，使端粒长度变长，最终导致耐药的发生。然而这一推测还需通过功能实验进一步去验证。

3.3 端粒酶基因TEP1上GCAAG、TTGGC这两种单体型与乳腺癌患者化疗耐药风险相关

为进一步证实端粒酶基因多态性与乳腺癌化疗敏感性之间的关联，我们对 TEP1基因上的 rs2678685、rs1713449、rs1760897、rs872072、rs938886位点进行单体型构建及连锁不平衡分析，发现端粒酶基因TEP1上GCAAG、TTGGC这两种单体型可增加乳腺癌患者化疗耐药风险。这一结果说明端粒酶基因多态性位点可能与乳腺癌化疗耐药存在相关性，未来还需扩大样本量继续探究其与乳腺癌耐药的相关性。