西瓜叶片防御酶活性变化与病毒病抗性的关系

赵卫星，康利允，高宁宁，梁 慎，常高正，徐小利,李海伦，王慧颖，李晓慧

(河南省农业科学院 园艺研究所，河南 郑州 450002)

小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)病在我国西瓜产区普遍发生，是严重危害我国西瓜生产的主要病害之一[1]，一般可造成减产15%～20%，严重时达50%左右，甚至绝收[2]。相关研究表明，植物受到病原物侵染后会发生一系列由生物活性酶调控的生理生化变化，这种酶活性的变化一定程度上反映了寄主与病原的互作关系[3-5]。毛爱军等[6]研究认为，辣椒幼苗受到疫病病原菌侵染后引起体内相关防御酶活性的变化来抵抗病菌侵染；邹芳斌等[7]研究认为，黄瓜枯萎病抗性与防御系统中几种酶活性密切相关。在茄子黄萎病[8]、大豆病毒病[9]、甜瓜蔓枯病[10]和水稻白叶枯病[11]等作物病害的研究中，利用防御酶含量或活性水平变化作为抗病性鉴定的生化指标已有相关报道。目前，有关西瓜ZYMV的研究多集中在病毒检测、抗性资源与品种鉴定、抗性基因的分子标记等方面[12-14]，而防御酶活性与西瓜抗ZYMV的关系研究鲜见报道。鉴于此，以抗性不同的西瓜品系为材料，采用摩擦法人工接种ZYMV，测定接种后西瓜叶片相关防御酶活性的变化，探讨病变过程中防御酶活性的变化与西瓜品系抗性之间的关系，筛选抗性鉴定指标，为进一步阐明西瓜抗ZYMV机制并进行合理的生理调控以及抗性资源快速评价提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试西瓜品系：野生西瓜PI595203(高抗小西葫芦黄花叶病毒病，HR)，从美国先正达种子公司引进；W18-18(抗小西葫芦黄花叶病毒病，R)、18-268-2(感小西葫芦黄花叶病毒病，S)是河南省农业科学院园艺研究所通过室内人工接种和田间病圃法鉴定得到的抗、感品系。

供试病毒：小西葫芦黄花叶病毒，由中国农业科学院郑州果树研究所彭斌博士提供。

1.2 方法

挑选饱满一致的西瓜种子，55 ℃温汤浸种6 h，用湿毛巾包裹置于28 ℃恒温培养箱内催芽，为保证出苗一致性，野生西瓜种子先人工破壳再催芽；待种子露白后选择芽长基本一致的种子播种于装有灭菌基质[V(蛭石)∶V(珍珠岩)=1∶1]的32孔穴盘中，在25～28 ℃温室内育苗，子叶生长期内每7 d浇灌一次1/2Hoagland营养液，真叶展出后每隔4～5 d浇灌一次Hoagland完全营养液。待幼苗长至三叶一心时，采用人工摩擦法接种ZYMV，以不接种ZYMV为对照(CK)，3个品系共6个处理，每个处理重复3次。育苗期间温度和光照按常规育苗管理进行。

1.3 防御酶活性测定

分别于接种后0、2、4、6、8、10 d取接种部位的叶片进行相关酶活性测定，每个处理随机取5株，重复3次。超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑光化还原法，过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚法，多酚氧化酶(PPO)活性测定采用邻苯二酚法，苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定采用苯丙氨酸法，过氧化氢酶(CAT)活性测定采用紫外吸收法，以上各种酶活性测定均参照赵世杰[15]的方法进行。

1.4 数据统计与分析

采用Excel 2013和DPS 7.05进行数据统计与作图，采用Duncan’s法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同抗性西瓜品系叶片SOD活性变化

3种不同抗性西瓜品系未接种处理叶片SOD活性在各处理时期无显著性差异，接种ZYMV后，叶片SOD活性均显著升高(图1)。其中，高抗和抗性品系叶片SOD活性增加迅速，在接种后第4天达到高峰，分别比对照提高29.80%和23.72%，且高抗品系显著高于抗性和感病品系；感病品系叶片SOD活性在接种后第6天达到峰值，比对照提高14.29%，显著低于高抗品系，与抗性品系间差异不显著。随接种后时间的延长，叶片SOD活性变化幅度逐渐缩小。可见，ZYMV可诱导提高SOD活性抵抗病源的侵染，3个品系叶片SOD系统响应的快慢顺序依次为高抗、抗性、感病。

2.2 不同抗性西瓜品系叶片POD活性变化

不同抗性西瓜品系叶片POD活性变化有明显差异(图2)。由图2可见，未接种ZYMV处理，高抗和抗性品系西瓜叶片POD活性在各个处理时期均高于感病品系，但差异未达显著水平；接种ZYMV后，不同抗性品系叶片POD活性均显著升高，高抗和抗病品系升高幅度高于感病品系，高抗和抗性品系在接种后第4 天达到峰值，分别比对照升高63.44%、58.13%；感病品系在接种后第6 天达到峰值，比对照提高50.42%。说明高抗西瓜品系叶片POD系统较为敏感，对病原物的刺激反应迅速，抗性品系次之，感病品系反应能力相对较弱。

2.3 不同抗性西瓜品系叶片CAT活性变化

不同抗性西瓜品系叶片CAT活性对ZYMV刺激的响应有明显差异(图3)。高抗和抗性品系叶片CAT活性在接种后第4天达到峰值，分别比对照提高55.62%和43.98%；感病品系在接种后第6天达到峰值，比对照提高39.78%。未接种处理，高抗和抗性品系叶片CAT活性均略高于同时期的感病品系，差异不显著，接种后在多个测定时期内差异达显著水平。接种后第10天，感病品系叶片CAT活性为12.84 U/g，分别为高抗、抗性品系的75.23%、80.06%。可见，接种ZYMV可显著诱导提高西瓜叶片的CAT活性，高抗和抗性品系启动CAT系统早于感病品系。

2.4 不同抗性西瓜品系叶片PAL活性变化

由图4可见，未接种处理，感病品系西瓜叶片PAL活性略低于高抗和抗性品系，但差异未达显著水平；接种ZYMV后，不同抗性西瓜品系均呈现先上升后下降再上升的趋势，且高抗品系显著高于感病品系；高抗、抗性品系均在接种后第2天达到峰值，分别比对照提高了31.63%、19.35%，接种后第4天与第2天差异均不显著，直到第6天急速下降；感病品系在接种后第4天达到峰值，比对照提高15.91%，随后急速下降，再趋于平稳。总体来看，不同抗性西瓜品系接种ZYMV均可显著提高叶片PAL活性，高抗和抗性品系PAL活性出现的峰值早于感病品系，且PAL活性变化幅度大于感病品系。

2.5 不同抗性西瓜品系叶片PPO活性变化

由图5可见，未接种处理，3种不同抗性西瓜品系叶片PPO活性无显著差异，接种后叶片PPO活性迅速升高，高抗品系叶片PPO活性至接种第4天达到最大值，比对照升高35.77%，显著高于抗性、感病品系；抗性和感病品系叶片PPO活性在接种后第6天达到峰值，分别比对照提高25.74%和7.65%；在整个处理时期，3种不同抗性西瓜品系叶片PPO活性增幅无明显规律性。可见，接种ZYMV可显著提高西瓜叶片PPO活性，高抗品系对病原菌感知能力较强，较早提高PPO活性以抵抗病原菌的侵染。

3 结论与讨论

在植物抗病反应中，一些防御酶类起着重要的调控作用[16]，生物酶活性变化一定程度上反映寄主与病原的互作关系，通常植物通过提高相关防御酶的活性阻挡病原菌的侵染，从而提升自身的抗病性。本研究结果显示，3种不同抗性的西瓜品系接种ZYMV后，叶片SOD、POD、CAT、PPO、PAL活性均显著升高，可能是接种病原菌后激活了植株体内酶活性基因的表达，使植物自身对病菌侵染产生抗性反应，以适应不良逆境条件。这与陈亮等[17]对西瓜枯萎病和孙庆科等[18]对茄子黄萎病的研究结果一致。植株与病原菌的抗争是一个复杂的过程，研究认为，防御酶活性变化是寄主自身抗病性的一种体现，或是抵抗病原菌侵染过程中的一种伴生现象[19-20]，但其具体原因还有待于进一步研究。

植物抗病性的强弱取决于体内抗性基因表达后抗病反应的速度和抗病物质的积累量[21]。本研究发现，相关防御酶活性的变化因品系抗性不同而表现出明显差异，高抗和抗病品系叶片SOD、POD、CAT、PAL活性达到峰值的时间均早于感病品系，且高抗和抗病品系活性较对照增幅大，感病品系的活性增幅较小，可能是抗性品系对病原物的刺激反应迅速，较早地启动了防御酶系统，提高防御酶活性以抵抗病原菌的侵染；感病品系虽然也有一定的防御能力，但其反应速度及强度较弱。这与史凤玉等[22]对野生大豆花叶病毒、陈亮等[17]对西瓜枯萎病和李淼等[23]对猕猴桃溃疡病的研究结果相似。说明这4种酶活性水平与西瓜对ZYMV的抗性密切相关，是其抗病的一个重要因素。李振岐等[24]对小麦锈病的研究认为，植物所含抗病基因和遗传背景的差异，可以通过体内防御性酶活性的变化来反映。因此，可将这4种酶活性增幅和峰值出现时间的早晚作为西瓜抗ZYMV的鉴定指标，以快速评价出不同西瓜品系对小西葫芦黄花叶病毒病的抗性水平。

PPO在植物抗病反应中参与酚类物质的氧化，促进木质素和醌类物质的形成，从而导致病毒扩展受阻[25]。本研究结果显示，接种ZYMV后，高抗品系叶片PPO活性出现峰值的时间早于感病品系，可能高抗西瓜品系PPO系统对病原菌的感知能力较强，加速木质素形成和醌类物质积累。这与史凤玉等[22]对野生大豆花叶病毒和张建军等[26]对小麦梭条花叶病毒的研究结果一致。而马艳玲等[27]研究则认为，黄瓜接种枯萎病菌后PPO活性无明显变化，造成这种差异的原因可能与所选品系自身的抗病性有关，本研究中抗性品系叶片PPO活性增幅无明显的规律性，也这证实了这一点；酶促反应是一个复杂的生理过程，也可能与作物酶系统参与不同病害侵染应答机制差异有关，其具体原因还有待进一步证实。

综上所述，西瓜品系叶片SOD、POD、PAL、CAT、PPO活性越高，抗ZYMV能力越强；高抗和抗性品系的叶片SOD、POD、CAT、PAL活性出现的峰值时间和峰值期酶活性增幅均高于感病品系，这4种酶活性变化与西瓜病毒病抗性密切相关，在抗病生理机制中起重要作用，其酶活性峰值出现的时间及增幅大小可作为西瓜ZYMV抗性筛选的重要生理指标。