光敏色素互作因子OsPIL15基因对水稻磷、氮吸收利用的影响

李丹阳,张晓花,刘灵芝,孙红正，李俊周，彭 廷，张 静，杜彦修,赵全志

(河南农业大学 农学院/河南粮食作物协同创新中心/河南省水稻生物学重点实验室，河南 郑州 450046)

水稻(Oryzasativa)是我国重要的粮食作物，60%的人口以稻米为口粮。因此，水稻的稳产和增产对保障我国粮食安全具有重要意义。水稻的稳产和增产主要靠“良种良法”，而化肥的合理使用是“良法”的必然措施。我国农业生产中存在化肥施用过量的问题，导致资源浪费和环境污染。因此，寻找作物营养元素高效吸收利用基因以降低化肥施用量，一直是农业科学家关注的热点。

磷在水稻生长发育中起着重要作用，是生物膜、核酸和蛋白质的重要成分，参与能量代谢、物质合成、信号响应和转导等过程[1]。我国近2/3 的耕地缺磷，需要施用磷肥维持和提高作物产量[2-3]。我国水稻生产上磷肥施用量较高且利用率低，地表径流损失是稻田磷素流失的主要途径[4]。鉴定磷高效吸收利用相关基因，提高水稻对磷的吸收利用率是解决磷肥浪费的重要手段。目前，已从水稻中鉴定了多个磷吸收、转运及调控相关基因[5-7]。植物从土壤吸收无机磷主要由PHT1 (Phosphate transporter 1)家族负责[5]。水稻中有 13 个PHT1成员(OsPHT1;1—OsPHT1;13)[6]，除了具有吸收磷的功能外,部分PHT1成员还具有磷的运输功能，例如OsPHT1;2、OsPHT1;3、OsPHT1;6和OsPHT1;8都具有将磷从根向茎运输的功能[7]。磷从根向茎的长距离运输主要由含SPX结构域的磷转运蛋白家族负责，在水稻中有6个SPX亚家族蛋白OsSPX1—OsSPX6和3个SPX-EMS家族蛋白OsPHO1;1、OsPHO1;2和OsPHO1;3[8-9]。植物对缺磷信号的响应受多种转录因子的调控，包括PHR(Phosphate response)、WRKY、MYB (V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)和bHLH(Basic helix-loop-helix protein)家族等[10-12]。其中,OsPHR1和OsPHR2通过调节磷饥饿诱导基因的表达而参与磷饥饿信号通路[10]。研究发现，光敏色素感知红光和远红光，通过其下游的光敏色素互作因子(Phytochrome interacting factor,PIF)调控种子萌发、形态建成、避荫反应、诱导开花和生物节律等生命活动[13-15]。拟南芥中有5个光敏色素基因(PHYA—PHYE)、至少8个PIF基因(PIF1—PIF8)[16-19]。进一步研究发现，拟南芥phyB突变体磷吸收降低，并揭示了PHYB通过PIF4/PIF5 和HY5(Long hypocotyl 5)调节磷饥饿响应基因PHT1和PHL1(PHR1-like 1)，进而调控磷吸收[20]。水稻中有6个PIL(Phytochrome interacting factors-like)基因(OsPIL11—OsPIL16)，调控水稻抽穗、籽粒大小、叶绿素合成、衰老、盐和冷胁迫响应等[21-26]，但水稻PIL对磷吸收利用的影响研究还未见报道。另外，植物对氮、磷的吸收存在互作[27]，磷饥饿时会影响植物对氮的吸收[28]。为此，以Ospil15突变体为材料，研究正常磷和低磷条件下OsPIL15基因对磷吸收利用的影响，并进一步分析OsPIL15基因对氮吸收利用的影响，以期为解析OsPIL15基因调节磷、氮吸收利用的分子机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 水稻材料

本研究使用的水稻材料为日本晴(Nipponbare,Nip)和Ospil15突变体。Ospil15突变体是以日本晴为背景，利用CRISPR/Cas9技术获得的敲除突变体的T8材料。

1.2 OsPIL15基因在低磷胁迫下的表达分析

登录Transcriptome ENcyclopedia of Rice数据库(https://tenor.dna.affrc.go.jp/)，输入OsPIL15转录本号进行查询，获得在正常和低磷胁迫下的OsPIL15基因表达量并进行分析。

1.3 材料培养及低磷胁迫处理

水稻材料在人工气候室(光照2 000 lx、16 h、28 ℃/黑暗8 h、22 ℃)培养。挑选饱满的水稻种子，用9%NaClO消毒10 min，自来水冲洗6次，蒸馏水洗5～6次，然后在28 ℃黑暗条件下置于无菌水中浸泡催芽2～3 d。将萌发一致的种子移到96孔板中，先用清水在人工气候室培养7 d，然后采用Hoagland营养液进行磷处理，正常磷(Normal P，CK)处理浓度为300 μmol/L NaH2PO4，低磷(Low P，LP)胁迫处理浓度为10 μmol/L NaH2PO4。前3 d分别配制1/4、1/3、1/2Hoagland营养液进行培养，此后采用Hoagland全浓度营养液进行培养，营养液每2 d更换一次，培养至四叶一心时测定生物量和磷、氮含量。

1.4 测定项目及方法

1.4.1 生物量 分别挑选正常磷与低磷胁迫处理的水稻植株各10株，用去离子水反复清洗根及叶表面，吸水纸吸干其表面水分，使用直尺测量地上部与根长度，随后置于烘箱中，105 ℃杀青30 min，70 ℃烘干至恒质量，称干质量。

1.4.2 磷、氮含量 将材料剪碎至粉末状，混合均匀后称取0.2 g样品置于消煮管中，采用H2SO4-H2O2消煮法进行消煮，用去离子水将消煮液定容至50 mL，再用10 mm定量滤纸将其过滤至10 mL离心管中，使用AA3流动注射分析仪进行氮、磷含量测定，并计算磷和氮吸收效率、转运系数、利用率。

吸收效率=单株磷或氮含量/单株根干质量×100%；

转运系数=地上部磷或氮含量/根磷或氮含量；

利用率=单株氮或磷含量/单株干质量×100%。

2 结果与分析

2.1 低磷胁迫条件下OsPIL15基因表达分析

已报道拟南芥PHYB通过PIF4/PIF5 和HY5调节磷饥饿响应基因来调控磷的吸收[20]。为了研究水稻光敏色素互作因子基因OsPIL15在水稻中是否能够调控磷的吸收，利用已有基因表达数据库Transcriptome ENcyclopedia of Rice(https://tenor.dna.affrc.go.jp/)提取OsPIL15基因在低磷胁迫(0 μmol/L NaH2PO4)下的表达量，然后进行分析。结果发现，低磷胁迫下，OsPIL15基因在水稻地上部的表达量下降，而在根中的表达量基本不变(图1)，这表明OsPIL15基因响应磷胁迫，可能具有调节水稻磷吸收的功能。

2.2 OsPIL15基因对水稻生长的影响

由于OsPIL15基因受低磷胁迫诱导表达，故利用前期构建的敲除突变体材料Ospil15[26,29]，以野生型Nip为对照，设置正常磷(300 μmol/L)和低磷(10 μmol/L)2种磷浓度，研究低磷胁迫对Ospil15突变体和Nip生物量的影响。结果表明，低磷胁迫后Nip和Ospil15突变体的地上部长均降低，但是Nip降幅大于Ospil15突变体；低磷胁迫后，Nip根长变短，Ospil15突变体根长基本没有变化(图2a)。低磷胁迫后，Ospil15突变体和Nip的根、地上部干质量均降低，根干质量降低幅度小于地上部干质量(图2b)。2个材料相比，低磷胁迫后Ospil15突变体与Nip地上部干质量降低幅度基本一样，但Nip根干质量降低幅度(72.2%)大于Ospil15突变体(68.1%)。这表明低磷胁迫后Ospil15突变体的生长受影响较野生型小，特别是Ospil15突变体的根。

对低磷胁迫后的2个材料根长与地上部长的比值以及根干质量与地上部干质量的比值进行分析，发现低磷胁迫后根长/茎长、根干质量/地上部干质量均增大(图2c、d)，这表明在低磷胁迫条件下水稻通过自身协调后更加侧重了根的生长。

2.3 OsPIL15基因对水稻磷吸收转运的影响

本研究测定了Ospil15突变体和Nip 2个材料中的磷含量来分析OsPIL15基因对水稻磷素吸收的影响。结果发现，在正常磷条件下，Ospil15突变体根中磷含量显著大于Nip，Ospil15突变体地上部中磷含量大于Nip但不显著(图3a)。低磷胁迫条件下，2个材料单株磷含量均比正常磷条件下降低(图3a、b)。低磷胁迫条件下，Ospil15突变体根中磷含量显著高于Nip，地上部中磷含量显著高于Nip(图3b)。分析二者磷吸收效率发现，正常磷和低磷胁迫条件下Ospil15突变体磷吸收效率均大于Nip，低磷胁迫条件下增幅更大(图3c)。综上，无论是正常磷还是低磷胁迫条件下，Ospil15突变体磷含量和磷吸收效率均大于Nip，说明OsPIL15基因负调控水稻磷吸收，并且在低磷胁迫条件下OsPIL15基因对水稻磷吸收的负调控作用更强。

对Ospil15突变体和Nip的磷转运系数进行分析发现，在正常磷条件下，Nip的磷转运系数高于Ospil15突变体；在低磷胁迫条件下，Ospil15突变体的磷转运系数大于Nip(图3d)。这表明OsPIL15基因不仅影响水稻磷吸收，也调控磷从根向地上部的转运。

2.4 OsPIL15基因对水稻氮吸收转运的影响

氮是植物吸收的大量元素之一，植物对氮、磷的吸收存在互作[27]，磷饥饿时会影响植物对氮的吸收[28]。因此，本研究分析了Ospil15突变体和Nip中的氮含量来研究OsPIL15基因是否调控氮吸收。结果发现，低磷胁迫条件下，Ospil15突变体和Nip氮含量均比正常磷条件下降低(图4a、b)。Ospil15突变体在正常磷条件下，地上部中氮含量显著大于Nip，根中氮含量无显著差异；低磷胁迫条件下，根中氮含量显著大于Nip，地上部中氮含量无差异(图4a、b)。分析Ospil15突变体和Nip在正常磷和低磷胁迫条件下氮吸收效率，发现Ospil15突变体在正常磷和低磷胁迫条件下的氮吸收效率均高于Nip(图4c)。另外，分析正常磷和低磷胁迫条件下Ospil15突变体和Nip的氮转运系数，发现磷浓度降低后Ospil15突变体和Nip的氮转运系数均降低。在正常磷条件下，Ospil15突变体氮转运系数与Nip基本一致；低磷胁迫条件下，Ospil15突变体氮转运系数小于Nip(图4d)。综上，Ospil15突变体提高了水稻氮吸收；在低磷胁迫条件下，Ospil15突变体提高了根中氮含量，但减少了氮从根向地上部的转运。上述结果表明，OsPIL15基因负调控水稻氮吸收，且正调控氮从根向地上部的转运。

2.5 OsPIL15基因对水稻磷、氮利用率的影响

本研究不仅分析了Ospil15突变体对氮、磷吸收及转运的影响，还分析了其对磷、氮利用率的影响。对Ospil15突变体和Nip的磷、氮利用率进行分析，结果发现，Ospil15突变体在正常磷和低磷胁迫条件下磷、氮利用率均大于Nip(图5a、b)。这表明OsPIL15基因对水稻氮、磷利用率亦有负调控作用。

3 结论与讨论

磷是植物吸收利用的大量元素之一，我国有2/3的耕地缺磷，同时我国存在磷肥施用量大而利用率低的浪费情况。磷矿是不可再生资源，且磷矿资源的消耗加剧[30]。因此，必须改良栽培技术和培育高效吸收利用磷的作物品种。本研究以基因编辑技术获得的Ospil15突变体为研究材料，发现Ospil15突变体能提高对磷的吸收利用，这为培育高效吸收利用磷水稻品种和解析水稻磷吸收机制奠定了重要基础。

本研究发现，OsPIL15基因对低磷胁迫有响应，推测OsPIL15基因可能调控水稻磷吸收。在低磷胁迫条件下，Nip和Ospil15突变体单株磷含量均较正常磷条件下降低，这与郭再华等[31]的结论一致。Nip和Ospil15突变体在低磷胁迫条件下根长/地上部长和根干质量/地上部干质量均增加，这与刘文菊等[32]研究结果一致。低磷胁迫条件下，Ospil15突变体根长和地上部长降低幅度小于Nip，根干质量降幅小于Nip，地上部干质量降幅与Nip相近，说明其比野生型耐低磷。

Ospil15突变体无论在正常磷还是在低磷胁迫条件下均表现出较高的磷含量和磷吸收效率，这表明OsPIL15基因负调控水稻对磷的吸收。本研究发现，Ospil15突变体较野生型磷含量增加，说明OsPIL15基因负调控磷素吸收，与SAKURABA等[20]报道的光敏色素互作因子负调控磷吸收一致。

植物对氮、磷吸收存在互作现象[33-35]，低磷胁迫条件下水稻、烟草、大麦、玉米和大豆等作物氮吸收均减少[36-39]。本研究发现，与野生型相比，Ospil15突变体在正常磷条件下显著提高了地上部中氮含量，低磷胁迫条件下显著提高了根中氮含量；氮吸收系数在正常磷与低磷胁迫条件下均大于野生型。这表明OsPIL15基因在磷、氮互作下负调控氮素吸收。OsPIL15基因除调控磷、氮吸收外，对磷、氮的转运和利用亦有调控。与野生型相比，Ospil15突变体在正常磷条件下降低磷转运系数，在低磷胁迫条件下提高磷转运系数、降低氮转运系数，在正常磷和低磷胁迫条件下均提高了磷、氮利用率。这表明OsPIL15基因在调控水稻磷吸收转运以及氮、磷互作方面的机制十分复杂。