白术种子萌发过程中保护酶对盐胁迫的响应研究

刘文东，李金玲，赵致，曹国璠，王华磊，罗春丽

（1.贵州大学，贵州 贵阳 550025；2.贵州省药用植物繁育与种植重点（工程）实验室，贵州 贵阳 550025）

传统中药材白术系菊科苍术属白术（Atractylodes macrocephalae Koidz.）的干燥根茎[1]，为多年生草本植物。《神农本草经》中将白术列为上品，具有健脾益气、燥湿利水和止汗安胎的功效。近代研究揭示其有效成分为挥发油类、内酯类、多糖类和苷类等，且主要药理作用为抗癌、修复胃黏膜、抗炎镇痛、保肝、改善记忆力、调节脂代谢、降血糖和抑菌等[2]。因为人工采挖过度导致白术野生资源急剧下降[3]，人工栽培是白术生产的主要方式，但白术种子不耐贮藏且萌发过程极易感病，所以解决白术种子贮藏和萌发是亟需解决的问题。彭芳丽[4]、胡晓甜[5]和陈怡[6]等研究了不同贮藏条件对白术种子质量的影响，但对白术种子萌发过程相关生理指标变化的系统研究尚有欠缺，所以亟需探明白术种子萌发过程中生理指标动向及环境条件变动对白术种子萌发的影响。本文通过跟踪研究白术种子整个萌发过程中白术种子的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）、可溶性蛋白和可溶性糖的变化情况，揭示其萌发过程中的相关生理指标变化规律，并设置不同浓度的NaCl溶液处理探究白术种子生理指标对盐胁迫的响应。通过生理指标变化状态揭示白术种子萌发过程中的抗逆生理，不仅得出白术种子自然萌发过程中的生理变化且探明了盐胁迫对白术种子萌发的影响，为白术的育苗提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料

供试白术种子于2018年采自贵州省铜仁市玉屏县朱家场镇铁柱山中药材园区白术种植基地，经贵州大学季祥彪老师鉴定为菊科苍术属白术。

1.2 试验设计

试验方法：随机挑选饱满、无病害的白术种子，用多菌灵500倍液消毒20 min后用蒸馏水反复清洗3次，将种子分别用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L的NaCl溶液浸种，另外一份用蒸馏水浸泡作为对照，浸泡时间都为24 h，将浸泡处理的种子采用双层滤纸培养法在25℃、无光照条件下培养，适时浇水保持湿润。

1.3 生理指标测定方法

经前期试验得出此种白术种子经上述处理后9 d左右即萌发完全，共取9 d的样品，将浸泡24 h后的种子作为第1天取样，放入培养箱后每天取一次样，每个处理每次随机取样15粒，所取样品用液氮速冻后放入-25℃下保存，待取样完成后一起测定。所有样品采用试剂盒方法（南京建成生物工程研究所）测定种子萌发过程中SOD、POD和CAT的活性，可溶性蛋白、可溶性糖和MDA参照张志良[7]的考马斯亮蓝染料结合法、蒽酮比色法和硫代巴比妥酸比色法测定。

1.4 数据处理

采用Excel 2010对数据结果进行图表绘制，SAS 9.4进行数据差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 白术种子萌发过程中SOD、POD及CAT的活性状态萌发天数

由表1中可知白术种子萌发过程中SOD、POD及CAT为30.78 U/g FW，从第4天开始显著上升，第9天达到最大值，为229.77 U/g FW；白术种子POD的活性随着萌发时间推进呈现先降低后上升趋势，第3天达到最小值变化情况。白术种子在整个萌发过程中SOD的活性呈现先缓慢降低，再迅速升高趋势，萌发第3天下降到最低值62.06 U/g FW且显著低于前2 d（P＜0.05），第5天开始迅速上升且显著高于前4 d，第7天达到最大值178.04 U/g FW，但后5 d不存在差异显著性；而整个萌发过程中种子CAT的活性总体呈现上升趋势，但显著不差异。

表1 白术种子萌发过程中相关生理指标多重比较（＜0.05）Table 1 The multiple comparison of related physiological indicators during seed germination(＜0.05)

表1 白术种子萌发过程中相关生理指标多重比较（＜0.05）Table 1 The multiple comparison of related physiological indicators during seed germination(＜0.05)

注：同列数据后所标字母相异表示差异显著（P＜0.05），所标字母相同表示差异不显著（P＞0.05）。Note:Different letters in the same precedence means significant difference between the treatments（P＜0.05）,same letter in the same row means not significant difference between treatments（P＞0.05）.

萌发天数Germination days SOD(U/g FW)POD(U/g FW)CAT(U/g FW)可溶性糖（mg/g）Souble sugar可溶性蛋白（mg/g）Soluble protein MDA（mol/g FW）第1天 The first day 81.93±7.42b 83.89±33.66bc 0.07±0.06c 217.33±22.24a 3.92±0.11a 0.06±0.05a第2天 The second day 68.12±19.37b 87.13±6.26bc 0.10±0.01abc 183.10±9.52b 3.10±0.55ab 0.05±0.01a第3天 The third day 30.78±0.84b 62.06±14.18c 0.07±0.01c 151.89±18.90c 2.23±0.59bc 0.07±0.04a第4天 The fourth day 53.89±18.85b 93.45±16.98bc 0.09±0.06bc 124.68±15.27d 2.23±0.58bc 0.08±0.01a第5天 The fifth day 178.61±18.01a 130.15±16.71ab 0.11±0.02abc 115.60±5.79d 1.90±1.00cd 0.08±0.002a第6天 The sixth day 216.75±51.71a 164.94±18.08a 0.13±0.02abc 84.46±10.00e 1.57±0.58cd 0.08±0.02a第7天 The seventh day 221.65±10.17a 178.04±7.29a 0.16±0.03ab 78.10±10.15ef 1.16±0.53de 0.06±0.006a第8天 The eighth day 222.19±20.77a 174.32±14.30a 0.15±0.02ab 56.51±10.51f 0.49±0.36e 0.05±0.007a第9天 The ninth day 229.77±13.93a 156.85±23.55a 0.18±0.07a 33.08±8.18g 0.38±0.16e 0.06±0.01a

2.2 白术种子萌发过程中可溶性蛋白、可溶性糖和MDA的变化趋势

如表1所示，白术种子萌发过程中可溶性糖呈现下降趋势，表1可知除了第4天和第5天、第6天和第7天、第7天和第8天之间不存在显著性差异之外，其余各组之间都存在显著性差异，萌发第1天可溶性糖含量最高，达到217.33 mg/g，第9天降到最低，仅为33.08 mg/g。由于白术种子在萌发过程中大分子多糖、脂肪等物质分解成小分子物质，用于生长合成，所以在萌发第1天可溶性糖含量极高，随着生长消耗慢慢降低，说明白术种子在萌发过程中可溶性糖含量下降明显。从表1可知，整个萌发过程中白术种子可溶性蛋白也是呈现逐渐下降趋势，但是下降幅度较可溶性糖缓慢，种子萌发第1天其可溶性蛋白达到最大值3.92 mg/g，萌发至第8天可溶性蛋白已经下降至很低，第9天达到最小值0.38 mg/g，说明可溶性蛋白减少程度较大。由表1可知，MDA在种子萌发过程中呈现着不规律变化，总体呈现先升后降状态，但是种子在整个萌发过程中MDA的含量不存在显著性差异，说明MDA的含量变化并不明显。可能原因是白术种子萌发过程没有受到胁迫导致MDA的含量在正常水平徘徊或种子萌发过程中各种保护酶的活性增加导致其含量一直没有显著变化，且有降低趋势。

2.3 NaCl处理对白术种子萌发过程中SOD、POD和CAT的影响

通过对比NaCl和CK处理白术种子同一萌发时间的相关生理指标变化得出NaCl处理对白术种子萌发的影响，由图1可知，各个氯化钠水平处理下白术种子SOD、POD和CAT都显著低于CK。由图1 A得出，经盐胁迫处理后白术种子SOD的活性显著下降，在各个盐浓度水平下呈现先降低后升高的趋势，仅有萌发第3、4天种子SOD的活性在NaCl 0.5 g/L和NaCl 1.0 g/L下显著高于对照，从第5天开始每个盐浓度水平下SOD的活性都显著低于CK。由图1 B可得，白术种子经不同浓度NaCl溶液处理后，随着萌发进程推进POD的活性缓慢上升，但各个盐浓度水平处理下POD的活性在整个萌发时期都显著低于CK。由图1 C可知，经过盐胁迫处理的种子CAT的活性远低于CK，且整个萌发时期种子CAT的活性呈上升趋势，萌发第6天以前CAT的活性在各个盐浓度水平处理下都低于对照，从第7天开始迅速上升且都显著高于CK，其中NaCl 1.5 g/L水平处理上升幅度最大。

图1 不同浓度NaCl处理下白术种子萌发过程中相关生理指标的影响Fig.1 The impacts of relevant physiological indicators during seed germination of treated with different concentrations of NaCl

2.4 NaCl溶液处理对白术种子萌发过程中可溶性糖和可溶性蛋白的影响

由图1 D可知，用NaCl溶液处理可以显著增加白术种子可溶性糖含量，随着NaCl浓度的增加可溶性糖含量显著增加，每个萌发阶段的每个NaCl水平处理都显著高于对照，从图1 D中可看出随着种子萌发进程的推进，种子中的可溶性糖含量不管是CK还是NaCl处理都在下降，但是NaCl处理组下降趋势显著低于CK，而从每个NaCl水平处理对可溶性糖含量影响下降趋势来看，随着NaCl浓度的增加下降的幅度就显著降低，而且在2.0 g/L和2.5 g/L NaCl水平下种子萌发过程中的可溶性糖含量下降幅度很小，特别是第6天以后2.0 g/L和2.5 g/L NaCl水平处理下的可溶性糖含量显著高于其他处理，初步说明当NaCl浓度高于2.0 g/L时会对种子造成不可修复的损伤。而从图1 E中可以看出白术种子在盐胁迫下萌发时其可溶性蛋白含量随着盐浓度的增加而升高，萌发第1天最高，为9.80 mg/g；在盐胁迫下萌发前3 d种子内的可溶性蛋白含量在各个水平间都存在显著差异且与浓度呈正相关，从第4天时开始缓和，说明种子在第4天开始恢复，而从第4天到第9天可以看出虽然种子的可溶性蛋白含量都有所下降，但是每个NaCl浓度水平处理下的可溶性蛋白含量都显著高于CK，除第7天2.5 g/L NaCl处理下种子可溶性蛋白显著高于其他水平处理之外，其余萌发阶段的水平处理之间并无显著差异，但显著高于CK。说明NaCl处理对种子萌发伤害很大，甚至0.5 g/L水平都会造成严重伤害。

2.5 NaCl溶液处理对白术种子萌发过程中MDA的影响

图1 F中显示的白术种子在NaCl胁迫下萌发时整个萌发时期MDA的含量变化，结果显示不同浓度的NaCl对白术种子萌发过程中MDA的含量影响巨大，可以看出种子萌发前4 d每个水平处理下MDA的含量都显著高于CK，而第4 d之后随着种子的慢慢修复，即各种氧化酶活性的增加导致MDA的含量也开始下降，在不同水平浓度NaCl处理下种子萌发过程中MDA的含量呈现先增加后降低趋势，增加的幅度和NaCl的浓度成正比，在2.5 g/L NaCl水平处理下增加幅度最大且最大值为17.77mol/mL FW；从趋势上可知，从第4天开始后MDA的含量开始下降，但是下降趋势在0.5g/L、1.0 g/L、1.5 g/L NaCl水平处理下降较急，而2.0 g/L和2.5 g/L NaCl水平处理下降较缓且MDA的含量显著高于CK，并没有下降到正常水平，相反从第5天在0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L NaCl水平处理下种子MDA的含量开始恢复到正常水平且与CK无显著差异，说明当NaCl浓度达到2.0 g/L以上时对种子的伤害巨大且恢复困难。

3 讨论

3.1 白术种子萌发过程中生理指标的变化

种子是农业生产的基础，更是种苗生产的基础途径之一，种子萌发和幼苗生长是植物对环境胁迫较为敏感的时期，其生长和生理特征极易受到周围环境的影响[8]，由于白术应用广泛，需求较大，全国各地皆有种植，但是其生产中存在品种退化和病虫害严重等问题[9]，所以探明种子萌发生理及环境条件对白术种子萌发的影响甚为重要。

本研究发现，随着白术种子萌发进程的推进，种子SOD、POD和CAT的活性总体都显著增高，而SOD和POD的活性在萌发前3 d缓慢下降，CAT的活性先缓慢升高然后缓慢下降，这可能是因为种子萌发前期这几种酶需要重新合成或需要激活，进而导致SOD、POD和CAT的活性在萌发前3 d变化并不大，这点与凃峰等[10]的研究有相似之处；相反白术种子的可溶性糖和可溶性蛋白含量在整个萌发过程呈显著下降趋势，说明白术种子在萌发时大分子物质在吸水之后快速分解，致使种子内的可溶性糖和可溶性蛋白含量在萌发开始时显著增加，但是后期新生组织和物质的合成导致种子内的可溶性糖和可溶性蛋白含量显著下降，这与杨敏等[11]对青蒿的研究基本一致，白术种子在整个萌发时期MDA的含量呈现先缓慢升高后降低趋势，但萌发阶段之间并没有显著差异。

3.2 不同NaCl浓度对白术种子萌发的影响

目前对于菊科苍术属植物苍术和白术最适宜萌发环境条件有一定文献报道[12-14]，但是对于在盐胁迫下白术种子萌发过程相关生理指标的变化研究较少，为探究此过程，本研究选择了可溶性糖、可溶性蛋白、MDA、SOD、POD和CAT 6项指标来评价白术种子对盐胁迫的响应。SOD、POD和CAT是清除膜质受损而产生的过氧化物，盐胁迫下其活性将上升以消除膜质过氧化产物，是能充分体现盐胁迫响应的指标之一[15]。研究显示，在不同浓度NaCl胁迫下白术种子SOD和POD的活性在整个萌发时期总体呈升高趋势，从响应情况得出盐胁迫导致白术种子细胞膜和胞内相关酶的活性降低甚至受损，且膜质过氧化程度高，此外试验过程中1.0 g/L以上盐胁迫浸种处理下白术种子萌发较差，说明白术种子耐盐能力较差，在盐的胁迫下极易导致内环境失衡，这与大多数的研究有相似之处[16-18]。其次，可溶性糖和可溶性蛋白是种子萌发不可或缺的基础能源物质，可溶性糖更是渗透调节物质之一，其含量有助于提高植物抗盐性，MDA则反映细胞膜的受损程度，细胞膜遭受破坏将导致细胞膜完整性下降进而增加MDA的含量[19,20]。白术种子萌发过程中可溶性糖和可溶性蛋白含量随NaCl浓度的增高在整个萌发时期呈下降趋势，但各处理都高于对照，说明白术种子对盐胁迫响应积极，但随着盐浓度增加其膜质可能受损而导致可溶性糖含量被动增加，进而影响种子萌发。此外MDA的含量在盐胁迫处理下都显著高于对照，且当NaCl浓度高于1.5 g/L时整个萌发时期都无法恢复正常水平，与已研究的结果吻合[21,22]。从MDA的含量即可推断白术种子在盐胁迫下其膜质过氧化程度随盐浓度增加而增强，细胞膜结构严重受损且通透性较强，因此导致可溶性糖含量上升，而此时种子严重伤害导致SOD、POD和CAT的活性也显著下降，进而导致MDA无法被消除，外部表现为整体萌发状况较差。

综上所述，盐胁迫严重影响白术种子萌发，造成白术种子膜质严重受损，相关酶的活性降低，内环境失衡进而导致萌发较差，所以种植白术应避开盐渍土壤。此外大量研究也表明连作会导致土壤负离子增加、酸度增加[23-27]，但有人报道药用植物对土壤中的离子影响较大，不同程度地降低土壤中水溶性Na+、K+含量，还会降低NaCl处理土壤中的水溶性Cl-、SO42-和HCO3-的含量[28]，所以有待进一步探索盐胁迫是否与连作障碍有联系。