长链非编码RNA FBXL19-AS1靶向miR-339-3p对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

董娜娜 郭瑞娟 付爱芹

1烟台市烟台山医院肿瘤内一科，烟台 264000；2烟台市烟台山医院东院肿瘤内科，烟台264000

长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)和微小RNA(microRNA, miR)是两类小分子非编码RNA，两者通过相互作用参与肿瘤的发生和发展，可作为肿瘤靶向治疗的分子靶点[1-3]。F-box和富含亮氨酸的重复蛋白19反义RNA 1(FBXL19-AS1)属于lncRNA，lncRNA FBXL19-AS1在胃癌[4]、非小细胞肺癌[5]和乳腺癌[6]等肿瘤中表达升高，促进肿瘤发展进程。但lncRNA FBXL19-AS1对胰腺癌发生发展的影响未见报道。Starbase生物信息学软件预测显示，lncRNA FBXL19-AS1可能靶向结合miR-339-3p。研究表明，miR-339-3p在胃癌细胞中呈低表达，上调其表达可抑制胃癌细胞增殖并促进细胞凋亡[7]；miR-339-3p在结直肠癌组织和细胞系中表达下调，过表达miR-339-3p可抑制结直肠癌肿瘤生长和转移[8]。但miR-339-3p对胰腺癌发生发展的影响也未见报道。本研究检测lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p在胰腺癌组织和细胞中的表达水平，观察其对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力及相关蛋白表达的影响，验证lncRNA FBXL19-AS1与miR-339-3p的靶向关系，以期阐明lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p在胰腺癌发生发展中的作用，为胰腺癌治疗提供新的分子靶点。

资料与方法

一、胰腺癌组织、细胞株lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p表达检测

收集2017年1月至2019至8月间烟台市烟台山医院手术切除且病理确诊的73例胰腺癌患者的癌组织及匹配的癌旁正常胰腺组织(距离手术切缘>3 cm)。TNM分期：Ⅰ期10例、Ⅱ期18例、Ⅲ期34例、Ⅳ期11例；低分化35例、中分化28例、高分化13例。患者术前均未接受放疗或化疗等辅助治疗。所有标本取下后立即置-196℃液氮中保存。

应用Trizol法抽提胰腺癌和癌旁组织总RNA，应用 RNA逆转录与扩增试剂盒(大连宝生物工程有限公司)逆转录成cDNA，按说明书操作。转录的cDNA行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)反应。lncRNA FBXL19-AS1正向引物序列为5′-GGT-ACAACTACGGATATGA-3′，反向引物序列为5′-TACGTCTCGACCATTACGCA-3′；miR-339-3p正向引物序列为5′-CGACATACGACTACGAGATA-3′，反向引物序列为5′-CGATTTACGATACGCAAGACGA-3′；内参GAPDH正向引物序列为5′-CGACTC-AGCGACGAGTCGA-3′，反向引物序列为5′-CTA-CGATACGGGAACAACGTCCG-3′；内参U6正向引物序列为5′-CGCTACGACTCGCGCTCTTC-3′，反向引物序列为5′-CTCGCGGCCAAGAGCTAGCG-3′。引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成。PCR反应条件：95℃ 5 min，95℃ 10 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，35个循环。通过PCR仪器自带软件获取扩增产物的Ct值，采用公示2-△△Ct计算lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p相对表达量。每个样品设3个复管，取均值。

正常胰腺上皮细胞株hTERT-HPNE及胰腺癌细胞株Capan-1、SW1990和PaTu8988均购自武汉普诺赛生命科技有限公司。常规复苏、传代。取对数生长期细胞，采用上述相同方法检测lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p的表达量。

二、胰腺癌Capan-1细胞分组及检测

1．Capan-1细胞分组：将Capan-1细胞分为NC组 (正常对照组)、si-NC组(转染无意义阴性序列)、si-FBXL19-AS1组(转染FBXL19-AS1小干扰RNA)，miR-NC组(转染空质粒对照)、miR-339-3p组(转染miR-339-3p过表达慢病毒载体)，si-FBXL19-AS1+anti-miR-339-3p NC组(共转染FBXL19-AS1 siRNA和miR-339-3p抑制剂阴性对照序列)、si-FBXL19-AS1+anti-miR-339-3p组(共转染FBXL19-AS1siRNA和miR-339-3p抑制剂)。所有siRNA、anti-miR构建及慢病毒包装均由上海生工生物工程有限公司完成。以病毒∶细胞为100∶1的比例感染细胞24 h，更新培养液，以含1 g/ml嘌呤霉素的DMEM培养液处理24 h以杀死未被感染的细胞，取存活并感染的细胞进行培养及传代。

2．Capan-1细胞增殖活性检测：取NC组、si-NC组、si-FBXL19-AS1组、miR-NC组、miR-339-3p组、si-FBXL19-AS1+anti-miR-339-3p NC组、si-FBXL19-AS1+anti-miR-339-3p组Capan-1细胞，以2.5×104个/孔接种于96孔板，分别培养0、12、48、72 h，到时间点加入10 μl CCK-8(日本株式会社)继续孵育2 h，上酶标仪测每孔在波长450 nm处的吸光值(A450值)。

3．Capan-1细胞迁移和侵袭能力检测：取上述各组对数生长期Capan-1细胞，调整为细胞密度5.0×104个/ml的细胞悬液。将Transwell小室(美国Corning公司)或预先在隔膜上室面铺设Matrigel基质胶并自然晾干后的Transwell小室置于24孔板。上室加100 μl细胞悬液，下室加500 μl培养液，培养24 h后弃培养液，轻轻擦去隔膜上室面未穿膜细胞，经4%多聚甲醛固定、结晶紫染色，置显微镜下以200倍随机取5个视野，计算穿膜细胞数，取均值。

4．Capan-1细胞cyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达检测：取上述各组对数生长期Capan-1细胞，以5.0×105个/孔接种于6孔板，培养24 h后用RIPA试剂提取细胞总蛋白。经BCA法定量蛋白后常规行蛋白质免疫印迹法检测cyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达，以β-actin为内参。一抗cyclinD1工作浓度1∶500，MMP2、MMP9和β-actin工作浓度均1∶1 000，辣根过氧化酶标记的二抗工作浓度1∶5 000。最后ECL发光，X片曝光、显影、定影。用Image J软件分析，以目的条带与内参条带的灰度值比表示蛋白相对表达量。

三、lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p的靶向关系验证

从Starbase数据库(http://starbase.sysu.edu.cn)搜索lncRNA FBXL19-AS1d的潜在靶向基因，通过双荧光素酶报告基因法验证lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p的靶向关系。取对数生长期Capan-1细胞，以1.0×105个/孔接种于6孔板，采用LipofectamineTM2000脂质体法，将野生型(wild type，WT)lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p mimics或miR-NC，突变型(mutant type，MT)lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p mimics或miR-NC共转染至Capan-1细胞，转染时间为6 h，更换培养液，继续培养24 h，收集细胞并裂解，应用双荧光素酶活性检测试剂盒检测荧光素酶活性，按试剂盒说明书操作。实验重复3次，取均值。

四、统计学处理

结 果

一、胰腺癌组织和各细胞株lncRNA FBXL19-AS1 和miR-339-3p表达量

胰腺癌组织及其癌旁正常胰腺组织lncRNA FBXL19-AS1表达量分别为2.96±0.21和1.00±0.13，癌组织显著高于癌旁正常胰腺组织，差异有统计学意义(t=67.804，P<0.05)。胰腺癌组织及癌旁正常胰腺组织miR-339-3p表达量分别为0.37±0.05和1.00±0.11，癌组织显著低于癌旁正常胰腺组织，差异有统计学意义(t=44.548，P<0.05)。

Capan-1、SW1990及PaTu8988细胞lncRNA FBXL19-AS1表达量分别为2.43±0.18、1.97±0.13和1.73±0.14，均显著高于hTERT-HPNE细胞的1.00±0.07，miR-339-3p表达量分别为0.42±0.03、0.54±0.03和0.57±0.04，均显著低于hTERT-HPNE细胞的1.00±0.05(F值分别为173.898、391.881，P值均<0.05)。其中以Capan-1细胞的lncRNA FBXL 19-AS1表达量最高， miR-339-3p表达量最低，故选择Capan-1细胞株进行后续实验。

二、敲减Capan-1细胞lncRNA FBXL19-AS1表达可抑制细胞增殖、迁移、侵袭及相关蛋白表达

si-FBXL19-AS1组lncRNA FBXL19-AS1表达水平显著低于si-NC组(0.42±0.02比1.04±0.08，t=22.556，P=0.000)，表明抑制lncRNA FBXL19-AS1表达的Capan-1细胞构建成功。

与NC组或si-NC组比较，si-FBXL19-AS1组细胞A450值、迁移细胞数、穿膜细胞数显著下降，cyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达量显著降低，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，而NC组与si-NC组各检测指标差异均无统计学意义(表1、图1)。提示抑制lncRNA FBXL19-AS1表达可以抑制Capan-1细胞增殖、迁移、侵袭及相关蛋白表达。

表1 正常对照组、si-NC组、si-FBXL19-AS1组Capan-1细胞增殖、迁移、侵袭和相关蛋白表达的比较

图1 正常对照组(1)、si-NC组(2)、si-FBXL19-AS1组(3)Capan-1细胞cyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达

三、miR-339-3p过表达抑制Capan-1细胞增殖、迁移、侵袭及相关蛋白的表达

miR-339-3p组miR-339-3p表达水平显著高于miR-NC组(1.73±0.14比1.00±0.07，t=13.991，P=0.000)，表明miR-339-3p过表达的Capan-1细胞株构建成功。与miR-NC组比较，miR-339-3p组Capan-1细胞A450值、迁移细胞数、穿膜细胞数显著下降，cyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达显著降低，差异均有统计学意义(P值均<0.05，图2、表2)。

图2 miR-NC组、miR-339-3p组Capan-1细胞cyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达

表2 miR-NC组与miR-339-3p组Capan-1细胞增殖、迁移、侵袭及相关蛋白表达的比较

四、抑制miR-339-3p可逆转敲减lncRNA FBXL19-AS1对Capan-1细胞增殖、迁移和侵袭的影响

si-FBXL19-AS1+anti-miR-339-3p组miR-339-3p表达水平显著低于si-FBXL19-AS1+anti-miR-NC组(0.47±0.03比1.00±0.07)，表明抑制miR-339-3p 表达的si-FBXL19-AS1细胞株构建成功。

与si-FBXL19-AS1+anti-miR-NC组比较，si-FBXL19-AS1+anti-miR-339-3p组细胞A450值、迁移细胞数、穿膜细胞数显著上升，cyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达量显著升高，差异均有统计学意义(P值均<0.05，表3、图3)。提示抑制miR-339-3p可逆转敲减lncRNA FBXL19-AS1对Capan-1细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

表3 si-lncRNA FBXL19-AS1+anti-miR-NC组与si-lncRNA FBXL19-AS1+anti-miR-339-3p组Capan-1细胞增殖、迁移、侵袭及相关蛋白表达的比较

图3 si-FBXL19-AS1+anti-miR-NC组(1)、si-FBXL19-AS1+anti-miR-339-3p组(2)Capan-1细胞cyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达

五、lncRNA FBXL19-AS1靶向调控miR-339-3p

通过Starbase生物信息学软件检索到lncRNA FBXL19-AS1与miR-339-3p的核苷酸序列存在连续结合位点(图4)。经双荧光素酶报告基因实验验证结果显示，共转染WT-lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p mimics组Capan-1细胞的荧光素酶活性显著低于共转染WT-lncRNA FBXL19-AS1和miR-NC组(0.47±0.04比1.00±0.10)，差异有统计学意义(t=14.763，P<0.05)，而共转染MT-lncRNA FBXL19-AS1和miR-339-3p mimics组与共转染MT-lncRNA FBXL19-AS1和miR-NC组Capan-1细胞的荧光素酶活性分别为1.03±0.11和1.01±0.09，两组差异无统计学意义(t=0.422，P=0.679)。提示野生组存在lncRNA FBXL19-AS1靶向调控miR-339-3p，而突变组沉默了lncRNA FBXL19-AS1表达，故不存在lncRNA FBXL19-AS1靶向调控miR-339-3p。

图4 lncRNA FBXL19-AS1与miR-339-3p的结合位点

讨 论

LncRNA是真核生物中广泛存在的参与调控细胞增殖、分化和凋亡的小分子非编码RNA，在肿瘤的发生、发展中起重要作用。研究表明，CASC19[ 9]、LINP1[10]和NT5E[11]等多种lncRNA在胰腺癌中高表达，促进胰腺癌的发展进程；而STXBP5-AS1[12]和MTSS1- AS[13]等lncRNA在胰腺癌中低表达，在胰腺癌的发展过程中起抑癌基因作用。lncRNA FBXL19-AS1是近年来新发现的一种lncRNA，参与多种肿瘤的发展进程。研究显示，lncRNA FBXL19-AS1在乳腺癌细胞呈高表达，沉默其表达可削弱乳腺癌细胞增殖能力并加剧细胞凋亡，其作用机制与靶向调控miR-876-5p/FOXM1有关[14]；肺腺癌组织中lncRNA FBXL19-AS1高表达，且与肺腺癌患者不良预后密切相关，敲减其表达可靶向上调miR-203-3p表达，阻滞肺腺癌细胞的周期进程，并抑制肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，可作为肺腺癌预后的生物标志物及治疗靶标[15]；lncRNA FBXL19-AS1在结直肠癌高表达，敲减其表达可靶向结合并上调miR-203表达，减弱体外结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭，抑制体内肿瘤生长和转移[16]。但目前未见lncRNA FBXL19-AS1影响胰腺癌发生发展的相关报道。

本研究结果显示，胰腺癌组织及Capan-1细胞lncRNA FBXL19-AS1表达升高，提示其可能促进胰腺癌的发展进程；敲减lncRNA FBXL19-AS1可显著降低胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，提示敲减lncRNA FBXL19-AS1可抑制胰腺癌细胞的恶性表型，延缓胰腺癌发展进程，可作为胰腺癌治疗的潜在的分子靶点。肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭受多种基因分子的调控，其中cyclinD1是细胞周期调控分子，可促进细胞周期由G1期向S期转变，加快细胞周期进程，促进细胞增殖[17]；MMP2和MMP9是基质金属蛋白酶家族成员，参与降解细胞外基质，促进肿瘤细胞迁移和侵袭[18]。本研究结果显示，敲减lncRNA FBXL19-AS1可抑制胰腺癌细胞cyclinD1、MMP2和MMP9的蛋白表达，提示其可能通过调控cyclinD1、MMP2和MMP9的表达来影响胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。

研究报道，miR-339-3p在胶质母细胞瘤组织和细胞中表达下调，其可靶向抑制IP6K2的表达，降低胶质母细胞瘤细胞增殖，并促进细胞凋亡[19]；miR-339-3p在黑色素瘤细胞系中表达降低，过表达miR-339-3p可靶向抑制MCL1，减弱黑色素瘤细胞的侵袭性，可作为抑制黑色素瘤细胞侵袭的分子靶点[20]。本研究结果显示，胰腺癌组织及细胞系中miR-339-3p的表达明显降低，过表达miR-339-3p对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭起抑制作用，提示miR-339-3p低表达是胰腺癌发生发展的促进因素，抑制miR-339-3p可逆转敲减lncRNA FBXL19-AS1对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，提示lncRNA FBXL19-AS1可能通过靶向负调控miR- 339- 3p来促进胰腺癌细胞的恶性表型，进而促进胰腺癌发展进程。通过Starbase生物信息学软件和双荧光素酶分析证实lncRNA FBXL19-AS1与miR-339-3p的核苷酸序列存在连续结合位点，lncRNA FBXL19-AS1靶向调控miR-339-3p，lncRNA FBXL19-AS1/miR-339-3p轴可能为胰腺癌的靶向治疗提供新的分子靶点。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突