榆栀止血颗粒对子宫内膜异位症大鼠PI3K/Akt信号通路及异位内膜体积的影响

杨春惠 侯顺玉 邱伍英

摘要 目的：探索榆梔止血颗粒对子宫内膜异位症大鼠磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路及异位内膜体积的影响。方法：构建子宫内膜异位症大鼠模型，随机分为模型组、榆栀止血颗粒低、中、高剂量组、孕三烯酮组，每组12只，另取12只设为假手术组，分组处理后处死大鼠，测定大鼠异位子宫内膜体积，以免疫组织化学染色检测大鼠异位子宫内膜组织中微血管密度（CD31阳性细胞表达），以免疫酶联吸附试验（ELISA）检测大鼠血清VEGF、MMP-9、IL-6、TNF-α水平;以蛋白免疫印迹法检测大鼠异位子宫内膜组织PI3K/Akt通路相关蛋白表达。结果：与假手术组比较，模型组大鼠CD31阳性细胞比例、血清VEGF、MMP-9、IL-6及TNF-α水平、异位子宫内膜组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt均升高（P<0.05）;与模型组比较，榆栀止血颗粒低、中、高剂量组及孕三烯酮大鼠异位子宫内膜体积、CD31阳性细胞比例、血清中VEGF、MMP-9、IL-6及TNF-α水平、异位子宫内膜组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt均降低（P<0.05），且榆栀止血颗粒各组之间呈剂量依赖性（P<0.05）;榆栀止血颗粒高剂量组与孕三烯酮组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：榆栀止血颗粒可抑制子宫内膜异位症模型大鼠内膜血管生成，减轻炎性反应，进而减小其异位内膜体积，可能通过阻滞PI3K/Akt信号传导实现。

关键词 榆栀止血颗粒;子宫内膜异位症;异位内膜体积;磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路

Effects of Yuzhi Zhixue Granules on PI3K/Akt Signal Pathway and Ectopic Endometrial Volume in rats with Endometriosis

YANG Chunhui1，HOU Shunyu2，QIU Wuying2

（1 Gynecology Department，No.1 People′s Hospital of Qujing City of Yunnan Province，Qujing 655001，China; 2 Gynecology Department，Longyan City Second Hospital of Fujian Province，Longyan 364000，China）

Abstract Objective：To explore the effects of Yuzhi Zhixue Granules on the signal pathway of phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B （PI3K/Akt） and the volume of ectopic endometrium in rats with endometriosis.Methods：The rat model of endometriosis was established and randomly divided into a model group，a low，middle，high dose Yuzhi Zhixue Granules group and a gestrinone group，with 12 rats in each group.Another 12 were set as sham operation group，the rats were killed after treatment，the volume of ectopic endometrium of rats was measured，the microvessel density （CD31 positive cell expression） was detected by immunohistochemistry，the levels of VEGF，MMP-9，IL-6 and TNF-α in serum were detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）; and the expression of PI3K/Akt pathway related proteins was detected by Western blot.Results：Compared with the sham operation group，the proportion of CD31 positive cell，levels of VEGF，MMP-9，IL-6 and TNF-α in serum，the p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt in the ectopic endometrium tissues of the model group were all higher （P<0.05）; Compared with the model group，the low，medium and high doses of Yuzhi Zhixue Granules and the ectopic endometrial volume of gestrinone rats，the proportion of CD31 positive cells，serum VEGF，MMP-9，IL-6 and TNF-α level，p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt of ectopic endometrial tissue were all decreased （P<0.05），and there was a dose-dependent relationship between Yuzhi Zhixue Granule groups （P<0.05）; there was no significant difference between high dose Yuzhi Zhixue Granule group and gestrinone group （P>0.05）.Conclusion：Yuzhi Zhixue Granule can inhibit the angiogenesis of endometrium，reduce inflammation and reduce the volume of endometrium，which may be achieved by blocking PI3K/Akt signal transduction.

Keywords Yuzhi Zhixue Granules; Endometriosis; Ectopic endometrial volume; Phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B signal pathway

中图分类号：R285.5;R711.71文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.03.013

子宫内膜异位症（Endometriosis，EMs）是女性子宫内膜组织转移、侵袭到宫腔以外的部位生长引发的妇科疾病，可导致患者出现下腹坠涨疼痛、不孕和痛经等临床症状，严重威胁女性的生殖健康，影响其生命质量及工作效率[1-2]。研究发现，炎性反应及异位内膜病灶血管生成在EMs的发生发展中起到重要作用，EMs患者血清中炎性细胞因子及血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）水平均有明显升高[2-4]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（Phosphatidylinositol 3-kinase/protein Kinase B，PI3K/Akt）信号可介导炎性反应和血管生成过程，抑制该信号激活，可降低炎性反应因子表达，减轻神经痛大鼠痛觉敏感性[5-6]，并可减弱血管生成，抑制EMs大鼠异位内膜生长，提示PI3K/Akt信号可能是EMs的治疗靶点之一[7]。榆栀止血颗粒又称妇科止血颗粒，主要由地榆、墨旱莲、栀子、牡丹皮、槐花等中草药组成，具有抗炎作用，其中地榆可抑制子宫内膜癌细胞生长，减轻炎性反应[8-9];牡丹皮配伍生地黄、栀子、当归等可治疗子宫内膜异位症、乳腺增生、子宫肌瘤等各种妇科疾病[10]。但榆栀止血颗粒是否可影响EMs大鼠PI3K/Akt信号通路及异位内膜生长，目前还不清楚，本文通过构建EMs大鼠模型，对此进行探讨。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级SD大鼠（湖南斯莱克景达实验动物有限公司），许可证号为SCXK（湘）2013-0004，雌性，体质量200～240 g，所有大鼠均饲养在我院动物房中，温度25 ℃，相对湿度50%，保持环境安静、干净、透气，清洁度达到SPF级，12 h/12 h间断光照，自由饮食、饮水，定期更换垫料，清洁、消毒鼠笼。

1.2.1 药物 榆栀止血颗粒（山东新时代药业有限公司，国药准字Z20130019）;孕三烯酮（英国罗素制药公司，生产批号：A20070002）。

1.2.2 试剂与仪器 大鼠二步法免疫组化试剂盒（北京绿源伯德生物科技有限公司，货号：E-IR-R212）;DAB试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司，货号：SNM477-ARB）;大鼠MMP-9 ELISA试剂盒（上海信帆生物科技有限公司，货号：XFE1233A）;大鼠IL-6、VEGF及TNF-α ELISA试剂盒、兔源GAPDH、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、羊抗兔二抗（Abcam公司，美国，货号：ab100772、ab100786、ab100785、ab181602、ab151549、ab138364、ab179463、ab38449、ab150077）;蛋白提取试剂盒、BCA试剂盒（上海碧云天公司，货号：P0027、P0011）等。酶标仪（Perkin Elmer公司，美国，型号：XElx800）;病理切片机、包埋机、烤片机（徕卡仪器有限公司，德国，型号：RM2016、EG1160、HI1220）;光学显微镜（尼康公司，日本，型号：SMZ745）;凝胶成像仪（杭州米欧仪器有限公司，中国，型号：GIS-500）;蛋白电泳仪、转膜仪（Bio-Rad公司，美国，型号：1659001、Trans-Blot Turbo）等。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 采用自体移植法建立EMs模型大鼠，具体步骤参考文献[11]：腹腔注射2.5%戊巴比妥钠溶液（剂量为45 mg/kg）麻醉SD大鼠，仰卧固定在操作台上，备皮、消毒，于下腹部正中开腹、分离子宫，剪取右侧子宫角处的部分组织，剥离子宫内膜，使用活检穿孔器从中取2个片段（直径为5 mm×5 mm）移植于肠系膜动脉血管丰富处，以抗生素冲洗腹腔、关腹、缝合。4周后开腹，当观察到移植物清晰可见，呈椭圆形或圆形囊泡，其中充满透明或含血液体，颜色显示为淡红色，高度大于等于2 mm，表面有大量血管，与周围组织紧密粘连时表示造模成功，共构建成功60只，随机分为模型组、榆栀止血颗粒低、中、高剂量组、孕三烯酮组，每组12只，另取12只仅开腹剪开子宫后缝合，设为假手术组。

1.2.2 给药方法 参照说明书及文献，进行剂量换算，将榆栀止血颗粒和孕三烯酮[12]分别溶于生理盐水，配制成浓度为0.1、0.2、0.4 g/mL的榆栀止血溶液及浓度为6 mg/mL的孕三烯酮溶液，药物处理组均以10 mL/kg的剂量灌胃，模型组和假手术组以等剂量生理盐水灌胃，1次/d，持续14 d。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 大鼠异位子宫内膜体积测定及标本采集末次给药24 h后，开腹观察各组大鼠异位子宫内膜生长情况，称量其体积。吸入乙醚麻醉大鼠后处死，经腹主动脉取血约5 mL，静置后离心（3 000 r/min，15 min），收集上清液，得到血清冻存在-80 ℃冰箱备用，然后解剖取出子宫，剥离假手术组正常子宫内膜组织和其余组异位子宫内膜组织，漂洗后各剪取约0.5 g冻存在液氮中备用，剩余子宫组织置于4%多聚甲醛溶液中固定，经低浓度到高浓度梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后，采用切片机切片，得到厚度为5 μm的常规病理切片。

1.2.3.2 大鼠异位子宫内膜组织微血管密度检测CD31是一种血小板-内皮细胞黏附分子，广泛表达于内皮细胞间紧密连接处，可介导血管生成，并反映微血管密度，可作為微血管标记物[13]。石蜡切片经脱蜡、高浓度到低浓度梯度乙醇依次处理后，置于0.3%H2O2溶液中孵育30 min（室温），以蒸馏水漂洗后分别以5%血清室温封闭2 h，CD31一抗4 ℃孵育过夜，然后参照说明书的步骤，使用大鼠二步法免疫组化试剂盒、DAB试剂盒进行免疫组化染色，再次以低浓度到高浓度梯度乙醇脱水、二甲苯透明后封片，以光学显微镜观察着色情况，每个切片任选5个视野拍照，计数CD31阳性细胞数及细胞总数，并计算CD31阳性细胞比例。CD31阳性细胞比例=CD31阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.2.3.3 大鼠血清中VEGF、MMP-9、IL-6、TNF-α水平检测 血清置于冰水浴中解冻，采用ELISA试剂盒检测其中VEGF、MMP-9、IL-6、TNF-α水平，具体操作参照各自说明书的步骤进行。

1.2.3.4 大鼠子宫内膜组织PI3K/Akt通路相关蛋白表达检测 采用蛋白提取试剂盒、BCA试剂盒提取冻存的子宫内膜组织中总蛋白并测定其浓度，具体操作參照各自说明书的步骤进行，根据结果将各组样品液蛋白浓度调整至相同，各组分别取10 μL样品液上样，于电泳仪中进行电泳，湿转，转移全部分离蛋白至硝酸纤维膜上，根据目的蛋白分子量截取条带放置在小盒中并做好标记，以5%的脱脂奶粉室温封闭2 h，然后分别以兔源p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、GAPDH一抗（稀释比例均为1∶2 000）4 ℃孵育过夜，TBST漂洗3次后，以羊抗兔二抗（稀释比例为1∶1 000）室温孵育2 h，TBST漂洗3次后，以化学发光法显色，并使用凝胶成像仪拍摄蛋白条带，以Quantity One软件分析图像，得出各组蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 24.0统计软件对研究数据进行统计分析，计量资料用平均数±标准差（±s）表示，多组间比较行单因素方差分析，2组间比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 榆栀止血颗粒对大鼠异位子宫内膜体积生长的影响 假手术组大鼠未见异位子宫内膜组织，模型组大鼠可见明显异位子宫内膜组织。与模型组比较，榆栀止血颗粒低、中、高剂量组及孕三烯酮大鼠异位子宫内膜体积均降低，且榆栀止血颗粒各组之间呈剂量依赖性（P<0.05）;榆栀止血颗粒高剂量组和孕三烯酮组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 榆栀止血颗粒对大鼠异位子宫内膜微血管密度（CD31阳性细胞表达）的影响 与假手术组正常子宫内膜比较，模型组大鼠异位子宫内膜CD31阳性细胞比例明显升高（P<0.05）;与模型组比较，榆栀止血颗粒低、中、高剂量组及孕三烯酮大鼠异位子宫内膜CD31阳性细胞比例均降低，且榆栀止血颗粒各组之间呈剂量依赖性（P<0.05）;榆栀止血颗粒高剂量组和孕三烯酮组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图1、表2。

2.3 榆栀止血颗粒对大鼠血清VEGF、MMP-9水平的影响 与假手术组比较，模型组大鼠血清VEGF、MMP-9水平明显升高（P<0.05）;与模型组比较，榆栀止血颗粒低、中、高剂量组及孕三烯酮大鼠血清VEGF、MMP-9水平均降低，且榆栀止血颗粒各组之间呈剂量依赖性（P<0.05）;榆栀止血颗粒高剂量组和孕三烯酮组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.4 榆栀止血颗粒对大鼠血清IL-6、TNF-α水平的影响 与假手术组比较，模型组大鼠血清IL-6、TNF-α水平明显升高（P<0.05）;与模型组比较，榆栀止血颗粒低、中、高剂量组及孕三烯酮大鼠血清IL-6、TNF-α水平均降低，且榆栀止血颗粒各组之间呈剂量依赖性（P<0.05）;榆栀止血颗粒高剂量组和孕三烯酮组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。

2.5 榆栀止血颗粒对大鼠子宫内膜组织PI3K/Akt通路相关蛋白表达的影响 与假手术组正常子宫内膜组织比较，模型组大鼠异位子宫内膜组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt明显升高（P<0.05）;与模型组比较，榆栀止血颗粒低、中、高剂量组及孕三烯酮大鼠异位子宫内膜组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt均降低，且榆栀止血颗粒各组之间呈剂量依赖性（P<0.05）;榆栀止血颗粒高剂量组和孕三烯酮组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图2、表5。

3 讨论

EMs传统上认为是由月经逆行引起的，作为一种育龄妇女常见的慢性疾病，引起患者痛经、性交痛、盆腔疼痛、不孕等并发症，威胁女性身心健康，并对国家卫生系统及个人家庭造成很大的经济负担[14-15]。EMs患者经常伴有慢性腹腔炎症及妇科炎症，异位内膜组织病灶处的血管异常增生及炎性反应是EMs的主要致病基础，抑制炎性反应和血管生成对EMs的治疗至关重要[15-16]。榆栀止血颗粒药方由地榆炭、墨旱莲、炒栀子、绵马贯众、仙鹤草、炒槐花、拳参、大蓟、侧柏叶（炒）、棕榈炭、牡丹皮、茜草、蒲黄炭、生地黄、白芍、黄芩、当归等中药组成。榆栀止血颗粒主要功效为清热、凉血、止血，用于排卵性功能失调性子宫出血所致的月经量等症状。组方榆栀散中的大部分药物具有消炎抗菌作用，包括地榆、牡丹皮、栀子、仙鹤草、大蓟、黄芩、拳参等，另外这些药物可改善微循环，有凝血止血机制作用，药物包括墨旱莲、槐花、茜草、当归等改善微循环和凝血止血作用较强。榆栀止血颗粒的消炎抗菌类中药可破坏细菌细胞壁结构，促使细菌凋亡，达到抑菌作用，同时这些药物可降低促炎因子表达，抑制炎性反应发生发展[8-10，17]。本文结果显示，EMs模型大鼠异位子宫内膜组织中CD31阳性细胞比例、血清VEGF、MMP-9、IL-6及TNF-α水平升高，IL-6和TNF-α作为促炎因子，可促使炎性反应发生及进展;MMP-9及VEGF可促进子宫内膜异位症的侵袭和血管形成[14-16]，上述结果表明EMs大鼠异位子宫内膜微血管密度明显增加，出现炎性反应。EMs大鼠经榆栀止血颗粒处理后，大鼠异位子宫内膜体积、CD31阳性细胞比例、血清中VEGF、MMP-9、IL-6及TNF-α水平降低，且随剂量升高而作用增强，表明榆栀止血颗粒可能减轻炎性反应，抑制异位子宫内膜血管生成，进而减小EMs大鼠异位子宫内膜体积，对EMs具有治疗作用。

PI3K/Akt作为体内调控炎性反应及血管生成过程的主要信号，是EMs的一个治疗靶点，抑制PI3K及Akt磷酸化，可降低炎性反应因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平，减轻炎性反应并下调VEGF表达，抑制血管内皮细胞迁移、增殖，还可抑制EMs大鼠血管生成，减小异位内膜体积[7，18-20]。但榆栀止血颗粒是否可调控EMs大鼠异位子宫内膜组织PI3K/Akt通路表达，目前还未见报道。本文研究结果显示，EMs模型大鼠异位子宫内膜组织PI3K/Akt通路相关蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt升高，提示PI3K/Akt信号参与介导EMs大鼠病理过程。经榆栀止血颗粒治疗后，大鼠异位子宫内膜组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt降低，且呈剂量依赖性，表明榆栀止血颗粒可抑制PI3K/Akt通路激活，改善EMs大鼠症状，并随剂量升高而作用增强。

综上所述，榆栀止血颗粒可降低PI3K/Akt通路蛋白的磷酸化水平，减轻炎性反应，抑制血管生成，进而减小异位内膜体积，为EMs的临床治疗提供了新参考，阻滞PI3K/Akt信号传导可能是其药理机制。但本文还未通过上调和下调PI3K/Akt信号而做对照验证，需进行后续的进一步研究。

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（2020-05-29收稿 责任编辑：王杨）