基于Box-Behnken设计-响应面法优化蜜麦麸的制备工艺

王俪桦，应泽茜，孙贝贝，汤璐璐，杜伟锋,*，葛卫红，李昌煜

1.浙江中医药大学药学院，浙江 杭州 310053

2.浙江中医药大学 中药炮制技术研究中心，浙江 杭州 311401

3.浙江中医药大学 中药饮片有限公司，浙江 杭州 311401

4.浙江中医药大学中医药科学院，浙江 杭州 310053

麦麸为禾本科植物小麦Triticum aestivumL.麦粒结构中的外种皮和糊粉层，性平，味甘、淡，具有和中益脾的功效[1]，其主要成分为阿魏酸[2]。《本草蒙荃》中记载“麸制抑酷性，勿伤上膈”的理论，《本草通玄》中也提到“麦麸资本谷气”，可见麦麸能缓和药物的燥性，增强疗效，除去药物的不快气味[3]。蜜麦麸为麦麸与蜂蜜共制后的产物，使用方法同麦麸，经蜜制后作为辅料可增强共制药物的色泽和疗效，是中药炮制中常用的固体辅料[4]。蜜麸炒法的特色在南方古药帮中广泛应用，目前，全国四大药帮中樟帮与建昌帮均使用蜜麸炮制药物。蜜麦麸炮制后的饮片能起到更好的矫味赋色作用，更能缓和药物燥性，增强补脾益气作用[5-6]，其多用于炮制白术、苍术、僵蚕、山药[7-10]等中药。然而，用传统方法蜜制麦麸的工艺性极强[6]，而且不同地区对于蜜麦麸的制备工艺各不相同，主要通过人为对其外观性状进行判断，导致蜜麦麸的质量难以把控，进而影响到蜜麦麸制品的质量。

响应面法是一种整合试验设计和数学建模的优化方法，已广泛运用于中药炮制、中药提取、中药制剂等工艺的优选[11-13]。本研究以蜜麦麸含水量、堆积密度、色度、阿魏酸含量的总评归一值为考察指标，以物料比例、加热温度、加热时间为考察因素，采用Box-Behnken设计-响应面法对蜜麦麸制备工艺进行优化，优选出最佳制备工艺，为进一步提高蜜麦麸质量提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

U3000 高效液相色谱仪，日本Dionex 公司，配有四元梯度泵、在线真空脱气机、自动进样器、恒温柱温箱，变色龙色谱数据工作站；Agilent Zorbax Eclipse Plus Phenyl-Hexyl 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；NT-xs105 电子分析天平，0.01 mg，瑞士Mettler Toledo 公司；DHZT-9070A 电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；DFD-700电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；C21-SDHCB9E10 SUPOR 电磁炉，浙江绍兴苏泊尔生活电器公司。

1.2 试药

麦麸（批号20190701）、炼蜜（批号20190701）均由浙江中医药大学中药饮片有限公司提供，并经浙江中医药大学中药饮片有限公司钱敏主管中药师按照《浙江省中药炮制规范》（2015年版）检测为合格产品；阿魏酸对照品，批号110773-201012，购于中国食品药品检定研究院，质量分数为99.8%；乙腈为色谱纯，美国Tedia 公司；水为娃哈哈纯净水；其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品的制备

根据《浙江省中药炮制规范》（2015年版）[14]记载，蜜麦麸制备方法为麸皮与炼蜜（加适量开水稀释）拌匀，搓散，过筛，干燥至不粘手为度，粉碎，过三号筛。

2.2 蜜麦麸指标检测

2.2.1 水分的测定 按照《中国药典》2015年版四部“0832 水分测定法”中“第二法（烘干法）”[15]计算蜜麦麸中含水量。

2.2.2 堆积密度的测定 蜜麦麸性状为黄褐色皮状颗粒，质较轻，手摸微有黏性，无霉变、无结块，味淡具有麦麸特殊香气，略带甜蜜香气。堆积密度按照颗粒质量与颗粒自然堆积所占据的表观体积之比计算。测定每100 dm3单位体积内蜜麦麸的质量，通过比值计算其堆积密度。

2.2.3 色度的测定[16]

（1）供试品溶液的制备：取蜜麦麸粉末1 g，精密称定，置具塞离心管中，加95%乙醇20 mL，连续振摇1 h，离心，吸取滤液5 mL，定容至10 mL，即得供试品溶液。

（2）吸光度（A）测定：蜜麦麸颜色在可见光区最大吸收波长为597 nm 左右，选择597 nm 作为检测波长，测定样品A值。

2.2.4 阿魏酸含量测定[17-18]

（1）对照品溶液的制备：精密称取阿魏酸对照品4.43 mg，置于50 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配成88.60 μg/mL 的对照品溶液，备用。

（2）供试品溶液的制备：精密称定样品粉末5 g，置于150 mL 量瓶中，加入甲醇50 mL，称定质量，超声（250 W，40 kHz）30 min，放至室温，用甲醇补足减失的质量，滤过，取续滤液25 mL，挥干溶剂，残渣加甲醇溶解稀释并定容至5 mL，即得。

（3）色谱条件：色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse Plus Phenyl-Hexyl 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温35 ℃；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液；梯度洗脱：0～15 min，10%～16%乙腈，体积流量0.8 mL/min；15～25 min，16%乙腈，体积流量0.8 mL/min；25～50 min，16%乙腈，体积流量0.6 mL/min；50～55 min，16%～20%乙腈，体积流量0.6 mL/min；55～60 min，20%～30%乙腈，体积流量0.6 mL/min；检测器：紫外检测器；检测波长320 nm；进样量10 μL。

（4）专属性考察：按“2.2.4（3）”项下色谱条件测定空白甲醇溶液、阿魏酸对照品溶液和蜜麦麸供试品溶液，色谱图见图1，结果显示，各组分分离度好，无干扰。

图1 空白甲醇(A)、阿魏酸对照品(B)、蜜麦麸供试品(C)的HPLC 图Fig.1 HPLC spectrogram of blank methanol(A),ferulic acid reference substance(B)and testing sample of honey wheat bran(C)

（5）线性关系考察：精密量取阿魏酸对照品溶液（108.6 μg/mL）1、2、4、6、8、10 μL，按“2.2.4（3）”项下色谱条件进行，测定峰面积。以对照品浓度为横坐标（X），各自对应的峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程Y＝0.626 8X＋9.687，R2＝0.998 1，表明阿魏酸在10.86～108.60 μg/mL 线性关系良好。

（6）精密度考察：取阿魏酸对照品溶液，按“2.2.4（3）”项下色谱条件，连续进样测定对照品6次，记录峰面积，计算阿魏酸峰面积RSD 值为2.69%，表明实验仪器精密度良好。

（7）稳定性考察：取蜜麦麸供试品溶液，按“2.2.4（3）”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、16、24 h 进样测定同一供试品溶液峰面积，记录峰面积，计算阿魏酸峰面积RSD 值为2.80%，表明供试品溶液在0～24 h 的稳定性良好。

（8）重复性考察：取同一蜜麦麸样品6 份，每份5 g，按“2.2.4（2）”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.4（3）”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算阿魏酸质量分数RSD 值为4.88%，表明重复性良好。

（9）加样回收率试验：取已测定阿魏酸含量的样品9 份，每份5 g，根据样品中阿魏酸含量按照高、中、低质量浓度比例分别加入对照品阿魏酸对照品溶液，按“2.2.4（3）”项下色谱条件测定峰面积，计算RSD 值。结果阿魏酸平均回收率为99.21%，其RSD 值为3.50%，结果表明本方法回收率良好。

2.3 蜜麦麸单因素考察

2.3.1 麸皮与炼蜜比例 采用麸皮与炼蜜比例分别为10∶2、10∶3、10∶4、10∶6，拌匀，搓散，过筛，干燥，进行蜜麦麸制备，按“2.2”项下方法检测所得蜜麦麸水分、堆积密度和色度及阿魏酸含量4 个指标，考察炼蜜用量对试验中所得蜜麦麸各指标结果的总评归一值[13]（overall desirability value，OD），利用Hassan 法对各效应值进行归一化，其归一值di＝(yi－ymin)/(ymax－ymin)，并对归一值求几何平均值，OD＝(d1，d2，…，dn)1/n，本实验的效应值为综合指标，综合指标越高越好。综合指标为0.351 8、0.652 0、0.515 0、0.163 8。蜜麦麸的综合指标随着炼蜜比例的增加呈上升趋势，在10∶3（30%）到达最高点后下降，故选择10∶2（20%）、10∶3（30%）、10∶4（40%），因此，选择这3 个水平进行后续优化实验。

2.3.2 加热温度 麸皮与炼蜜比例为10∶3 不变，采用不加热及80、90、100、120 ℃加热，加热时间均为90 s，拌匀，搓散，过筛，进行制备。按“2.2”项下方法检测所得蜜麦麸水分、堆积密度和色度及阿魏酸含量4 个指标，归一化后计算综合评分方法同上，其综合指标分别为0.084 1、0.462 4、0.548 8、0.325 0、0.163 8。随着温度的上升而升高，至90 ℃达到最大后呈下降趋势，因此选择80、90、100 ℃ 3个水平进行后续优化实验。

2.3.3 加热时间 麸皮与炼蜜比例为10∶3 不变，采用90 ℃加热，加热时间为70、80、90、100、120 s，拌匀，搓散，过筛，进行制备。测定归一化综合指标，其综合指标分别为0.276 4、0.438 4、0.576 5、0.315 6、0.272 0。综合指标随着制备时间的增加而升高，制备时间90 s 达到最高后下降，因此选择 80、90、100 s 3 水平进行后续优化实验。

2.3.4 炮制用蜜种类 麸皮与炼蜜、生蜜的比例为10∶3 不变，采用90 ℃加热，加热时间均为90 s，拌匀，搓散，过筛，进行制备。测定归一化综合指标，其综合指标分别为0.377 3、0.590 0。炼蜜与生蜜对蜜麦麸制备的影响明显，生蜜制备蜜麦麸不利于过筛，综合指标比炼蜜制备的蜜麦麸低，因此选用炼蜜进行蜜麦麸制备。

2.3.5 加水量 麸皮与炼蜜比例为10∶3 不变，分别不加开水和加入适量开水（炼蜜与开水比例分别为2∶1、1∶1、1∶2、1∶3），采用90 ℃加热，加热时间为90 s，拌匀，搓散，过筛，进行制备。同上文测定归一化综合指标，其综合指标分别为0.453 5、0.159 0、0.268 8、0.181 2、0.213 5。加水与否对蜜麦麸制备影响明显，不同比例的加水量对蜜麦麸制备影响差异较大，加水制备蜜麦麸便于拌匀，但水分含量过高，不易于搓散，综合指标比不加水制备所得蜜麦麸低，因此采用不加水制备。

2.4 Box-Behnken设计-响应面优化试验

2.4.1 试验设计 根据Box-Behnken设计-响应面法原理，根据单因素试验结果，选取麸皮与炼蜜比例（X1）、加热温度（X2）、加热时间（X3）作为因素，每个因素选取3 个水平，以综合指标为因变量，用Design-Expert 10.0 设计实验，试验因素及水平、试验设计与结果见表1。

表1 Box-Behnken 试验设计及响应值Table 1 Box-Behnken experiment design and response value

2.4.2 模型拟合与响应面结果分析 响应值与各因素进行回归拟合后，得到回归方程如下：Y＝0.63－0.015X1－0.033X2＋0.004 577X3－0.071X1X2－0.044X1X3－0.023X2X3－0.092X12－0.13X22－0.068X32，由表2 可知，该模型P＜0.000 1，具有显著性差异，而失拟项P＝0.278 9＞0.05，无显著性，说明响应值与预测值之间有较好的拟合度和可信度，因此该模型可用来作为蜜麦麸最佳制备工艺参数的预测模型。根据分析结果，因素中加热温度的P＜0.05，具有显著性差异，说明加热温度对蜜麦麸制备工艺具有显著影响；麸皮与炼蜜比例与加热温度的交互效应、麸皮与炼蜜比例与加热时间的交互效应、麸皮与炼蜜比例二次效应、加热温度二次效应、加热时间二次效应均P＜0.05，说明该因素对蜜麦麸制备工艺具有显著影响。

表2 方差分析结果Table 2 Analysis result of variance

采用Design Expert 10.0.1 软件绘制响应值与其中任意2 个因素的交互作用等高线图（图2）及响应面3D 曲面图（图3）。由等高线图可知，等高线图为椭圆形，表明麸皮与炼蜜比例与加热温度的交互效应、麸皮与炼蜜比例与加热时间的交互效应及加热温度与加热时间的交互作用均显著。由图3 可知，加热温度的曲面变化幅度大于麸皮与炼蜜比例曲面变化幅度；加热时间的曲面变化幅度与麸皮与炼蜜比例曲面变化幅度差异不大；加热温度的曲面变化幅度大于加热时间曲面变化幅度。因此，所选的各因素水平范围内，加热温度影响对蜜麦麸的制备工艺影响最大。通过求解回归模型的方程，以综合指标为评价指标优选蜜麦麸的最佳制备工艺为麸皮与炼蜜比例为10∶2.95，加热温度为89.88 ℃，加热时间为90.07 s，此时综合指标值为0.692 7。

图2 3 因素之间的交互作用图Fig.2 Graph of interaction between three factors

图3 三因素之间的交互作用3D 图Fig.3 3D Graph of interaction between three factors

2.4.3 最佳工艺验证 结合试验情况，调整方案为麸皮与炼蜜比例为10∶3，加热温度为90 ℃，加热时间为90 s，在此条件下进行试验，测得综合指标值分别为0.663 7、0.687 2、0.677 2，接近预测值，说明该制备工艺稳定、可行。根据该试验结果，将蜜麦麸制备工艺应用于生产进行验证，结果显示该工艺在实际生产中可行、稳定。结合实际生产的实用性，使用该制备工艺制备蜜麦麸操作方便，易搓散，过筛，黏性适中。

3 讨论

随着对蜜麦麸使用范围变大，不同省份对于蜜麦麸的制备工艺各有不同，并且对于蜜麦麸的评价指标只局限于外观形状，作为重要的炮制辅料，目前尚无完整的质量标准。本研究根据《浙江省中药炮制规范》（2015年版）中蜜麦麸制备工艺，通过单因素考察结果，确定麸皮与炼蜜比例、加热温度、加热时间为影响蜜麦麸制备的3 个因素，由于制备蜜麦麸的过程中，成分变化复杂，与其炮制品产生作用的成分尚不明确，阿魏酸作为麦麸的主要成分之一，本课题组发现在蜜制过程中其含量会发生变化[2]，因此选取含水量、堆积密度和色度及阿魏酸含量的总评归一值作为评价指标，采用 Box-Behnken设计-响应面优化试验对蜜麦麸制备工艺进行优化实验。

在实验过程中，本课题组发现在制备蜜麦麸时，由于生蜜黏度较炼蜜低，拌匀耗时长，并且在炮制饮片的过程中，饮片上色时间长且不易上色，还容易导致饮片炮制过度而引起焦片。加水后可便于拌匀，但会使蜜麦麸水分含量过高，在炮制饮片时容易起烟，进而影响饮片的质量，因此本实验采用炼蜜和不加水的方法制备。通过生产验证，使用该工艺炮制的蜜麦麸易搓散，黏性适中，证明该工艺在实际生产中稳定、可行。

目前，对于蜜麦麸的制备工艺研究较少，主要集中在其炮制饮片的化学成分和药效学研究[19-21]，蜜麦麸作为一种重要的炮制辅料，其质量的优劣直接关系到饮片的临床药效，本研究采用实验室小试的方法，对其最佳工艺进行探索，希望能为蜜麦麸中药质量控制的标准提供思考。后续还会继续将该工艺运用到炮制饮片及后续的药效学研究，将此工艺进一步完善。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突