氚水对λ-dsDNA结构影响的拉曼光谱分析和DFT模拟

邓 冰，董 亮，全 旖，王和义

中国工程物理研究院 核物理与化学研究所，四川 绵阳 621999

随着核技术的迅速发展以及核能的广泛应用，特别是以国际热核聚变实验反应堆(ITER)为代表的国内外可控热核聚变研究的大力发展，大量的氚将释放进入环境空间并且以HTO的形式进入生态循环[1]。此外，福岛核事故所产生的氚废水量逐渐增加[2]，日本政府宣布将于2022年夏天开始，分批将百万吨含氚废水直接排入大海，这导致氚可能引起的生物效应成为公众最关心的问题[3-6]。虽然受氚污染的水排放到环境中引起的生物效应可能相当小，但是由于天然水占生物物质的70%～90%，水分子是组成所有生物大分子整体的一部分也是细胞结构的组成部分，因此HTO一旦进入体内就会自由和迅速地在整个生物体中扩散，宏观层面上氚在全身的水池中保持平衡；更重要的是氚可以进入细胞内被结合到有机分子中，氚 β射线的短距离低能作用导致3H能量的吸收会即刻发生在3H核的附近，从而导致局部能量沉积，因此，微观层面上氚在体内各种有机化合物中的分布和作用不均匀[7-8]，氚原子的微小位置很可能是决定其生化后果的关键所在。而对于大多数细胞效应的敏感靶点是细胞DNA，已有研究充分证明了DNA损伤会导致细胞死亡、突变甚至癌症的发生[9-11]。

由于3H的β发射的平均能量和最大能量分别为5.69 keV和18.6 keV，在水(或软组织)中的平均范围约为0.5 μm(500 nm)，远远小于细胞的典型直径(10～30 μm)，甚至小于细胞核的直径(5～10 μm)。因此，评估氚在亚细胞水平造成的损伤是研究氚内照射效应的一个主要问题。由于氚发射的β粒子具有极低能量的电子但其线性能量转移(LET)值高于由高能光子(例如外部γ射线)相互作用产生的电子 (约400个离子对/μm)，这一较高的LET可能会导致更大的致癌效果[12]。因此，氚β辐射与DNA的相互作用是目前关于氚内照射生物效应的研究重点，已有的研究主要集中在DNA碱基损伤、碱基丢失、双螺旋断裂和双链断裂[13]等方面。拉曼光谱为研究核酸的结构表征提供了一定的优势。天然DNA在拉曼光谱中的带归属在文献[14-16]中得到了很好的描述。在最近的应用中已经发现，特定拉曼标记带的变化能够提供有关DNA结构变化的详细信息[17-18]。该方法已经用于区分二价阳离子与DNA的特异性和非特异性结合[19]，监测DNA和DNA/金属-离子配合物的热变性[20]，以及测量基因组DNA在缩合态和非凝聚态中质子/氘交换的动力学研究[21-24]。

本工作利用拉曼光谱和密度泛函理论(DFT)模拟研究不同活度浓度1×1011Bq/L和1×109Bq/L HTO作用下，不同剂量(50 mGy～8.0 Gy)作用后，天然λ双键脱氧核糖核酸(λ-dsDNA)结构细节的变化。试图阐释HTO-λ-dsDNA相互作用的分子机制。比较不同剂量率的HTO引起的λ-dsDNA损伤的差异，以助了解HTO生物效应的机制，为低剂量或低剂量率的HTO辐射后的随机性效应评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品制备

λ-dsDNA，美国Sigma-Aldrich。在0.2 mol/L NaCl中制备λ-dsDNA水溶液(约20 g/L)用于HTO和γ射线辐照实验。将含有4 mg λ-dsDNA的0.2 mL等体积试样与HTO(中国工程物理研究院核物理与化学研究所，放射化学纯度98%)混合。辐照后，将溶液在液氮中振荡冷冻，然后在保温瓶中运输。通过将样品冻干，来解决拉曼光谱测量中小体积和浓缩的λ-dsDNA溶液成分复杂性的问题。未经HTO或γ射线照射的标准样品经过上述相同处理程序制备。

1.2 辐照程序

1.2.1HTO辐照 通过不同活度浓度(1×109Bq/L和1×1011Bq/L)HTO分别照射λ-dsDNA溶液不同剂量(50 mGy～8 Gy)，持续时间为18.24 min～2 432 h。辐照后的样品首先在4 ℃下保存24 h，在冻干前保存于-20 ℃下。

1.2.2γ射线辐照 λ-dsDNA溶液用中国工程物理研究院核物理与化学研究所的60Co源辐照。60Co源(最大活度3.7 TBq)发出的光子能量为1.25 MeV。γ射线的传送剂量由校准的监视器控制，其辐照剂量为50 mGy、100 mGy和500 mGy，持续时间为1～10 min。

1.3 拉曼光谱

使用配备了20倍物镜的Leica Research显微镜的拉曼光谱系统(Renishaw公司)进行拉曼光谱测量。一个He/Ne激光系统，其激发线为532 nm，在样品空间处的激发能量约为25 mW。每个样品在室温(21～23 ℃)下测量6个光谱累积然后取平均值。为了避免测量期间波数标度所有可能的漂移，在样品光谱的累积测量后1 s收集校准光谱。拉曼数据的分析使用Origin 8.0软件(美国Microcal Origin)，从不同剂量下测得的光谱减去冻干的非辐照λ-dsDNA光谱，获得拉曼差异光谱。在减去之前，将所有光谱按比例缩放以在λ-dsDNA主干PO2对称拉伸振动的1 095 cm-1波段具有相等的强度。当谱带差异反映出其父代谱带强度变化至少5%时，被认为是有效的。

1.4 模拟计算

所有计算均使用高斯09程序[24]在DFT级别上进行。先前的研究表明，混合元交换关联M06-2X功能[25-27]在相互作用较弱的系统中表现良好。因此，使用M06-2X方法和6-311 ++ G(d，p)基组[28-31]进行了几何优化，用以定位静止点和过渡状态(TS)。零点振动能量(ZPVE)校正也应用气相中的相对能量。计算表明，B3LYP方法可以提供高度精确的能量，并且M06-2X/6-311 ++ G(d，p)水平将适合于研究系统。所有优化结构的振动频率均在同一水平上获得，并且该种类的振动频率表征为最小值(无虚数频率)或过渡态(唯一虚数频率)。

2 结果与讨论

图1显示了λ-dsDNA在不同活度HTO作用前后的拉曼光谱图，拉曼波段的归属概述列于表1。

表1 λ-dsDNA在HTO和γ射线作用后相关波段的归属

如图1所示，相较于1×1011Bq/L HTO辐射作用，核碱基的特征拉曼条带在1×109Bq/L HTO作用100～500 mGy后发生更明显的变化。在1×109Bq/L HTO 辐照100 mGy后可以看到，一些碱基和脱氧核糖的特征峰强度增加：1 463 cm-1(脱氧核糖)、1 303 cm-1(dC，dA)、1 185 cm-1(dG，dA，dC)、1 047 cm-1(脱氧核糖)、914 cm-1(脱氧核糖)和756 cm-1(dT，C2′-endo/anti)[39-41]，这些标记带的强度增加可归因于λ-dsDNA通过特殊碱基对非堆积和相应核苷中脱氧核糖构象的转变而部分变性[39,42]。特征峰1 056 cm-1表示两个主要的核酸含量比例的变化，其强度的增加也证明1×109Bq/L HTO作用100 mGy 会导致碱基对非堆积作用。此外，1 150～1 720 cm-1波段的拉曼峰归属于碱基的电子结构和碱基配对，其中1 200～1 600 cm-1波段区域被划分为嘌呤和嘧啶的环振动，是环电子结构的敏感指标[43-48]。相较于1×109Bq/L HTO 辐照100 mGy，辐照500 mGy后还会引起碱基归属峰1 575 cm-1(dA，dG)、1 371 cm-1(dT，dA，dC)、1 335 cm-1(dA，dG)、1 260 cm-1(dG，dC(NH2))强度的显著增加，提示碱基对非堆积作用进一步加强。除此之外，1×109Bq/L HTO辐照500 mGy后引起750～800 cm-1和1 050～1 100 cm-1区域的拉曼标记带强度的增加，两个标记带与C5′-O5′-P(O2-)-O3′-C3′链中的磷酸酯转角有关，强度的增加可能是λ-dsDNA螺旋构象的部分改变引起的[44-49]。提示，随着1×109Bq/L HTO与λ-dsDNA作用剂量的增加，碱基对非堆积作用增强并引起λ-dsDNA构象的变化。

(a)：1——DNA，2——100 mGy，3——500 mGy，4——2 Gy，5——4 Gy，6——8 Gy；(b)：1——DNA，2——50 mGy，3——100 mGy，4——500 mGy，5——2 Gy，6——4 Gy

(a)：1——100 mGy，2——500 mGy，3——2 Gy，4——4 Gy，5——8 Gy；(b)：1——2 Gy，2——500 mGy，3——100 mGy，4——50 mGy，5——4 Gy

键长单位为Å

(a)——ΔE=-9.67 kJ/mol，(b)——ΔE=-145.55 kJ/mol

(a)：1——DNA，2——100 mGy，3——500 mGy，4——50 mGy；(b)：1——50 mGy，2——100 mGy，3——500 mGy

同样，从图2还可以看到，1×1011Bq/L HTO与λ-dsDNA作用500 mGy后1 371 cm-1归属于dT内环振动的峰强度降低，而在1×109Bq/L HTO作用后一直没有出现此类现象。同样1×1011Bq/L HTO作用于λ-dsDNA后1 575 cm-1处波段强度持续减弱，而在1×109Bq/L HTO辐照后，该条带强度持续增加，在4 Gy辐照后峰强才出现明显减弱；提示1×109Bq/L HTO和1×1011Bq/L HTO与λ-dsDNA作用的区别在于，1×1011Bq/L HTO主要通过β射线的直接电离作用或质子化作用导致碱基结构的破坏从而引起λ-dsDNA主链的断裂，而1×109Bq/L HTO主要通过自由基分子的间接作用导致碱基结构、碱基对氢键损伤，从而出现碱基对非堆积效应引起λ-dsDNA构象的变化。然而，在更高剂量(4 Gy)的HTO作用下，碱基和λ-dsDNA主链的特征峰强度随1×109Bq/L HTO作用剂量的增加出现更明显的减弱和展宽，拉曼谱线的减少和展宽表明λ-dsDNA结构组分的降解和有序构象的丢失。因此，结果提示低剂量HTO的长期作用可通过自由基分子对λ-dsDNA产生更显著的破坏作用。

此外，呋喃糖在λ-dsDNA螺旋链的构成中起着重要的作用，尽管脱氧核糖在λ-dsDNA中给出较弱的拉曼谱线，这些谱线的特征不像核酸碱基的特征那么明显。但还是可以利用脱氧核糖的振动模式来识别辐射引起的呋喃糖和λ-dsDNA主链的变化[34-39, 53-54]。1×109Bq/L HTO作用2 Gy后，被指定为脱氧核糖振动的914 cm-1的条带处分裂成若干弱条带，在910～970 cm-1区域出现了一些新的特征峰，表明了呋喃糖环结构的变化，而这一现象可能是T-H的同位素交换引起的。同样的现象可以在1×1011Bq/L HTO作用2 Gy后看见，归属于dG环形呼吸振动的峰的波数从681 cm-1移动到694 cm-1，新波段的出现表示dG带发生扰动，提示dG中糖皱褶发生了变化[34]，特征归属dG呋喃环平面弯曲的新峰出现，提示可能是H-T的同位素作用的影响。此外，1 463 cm-1是脱氧核糖的两个CH2费米相互作用的拉曼标记，具有辐射敏感性。1×109Bq/L HTO作用2～8 Gy后，其强度随辐射剂量增加呈现依赖性消失，这可能是C-O或C-C键断裂导致脱氧核糖结构破坏的结果，该损伤能引起λ-dsDNA骨架单链断裂[36]；该特征峰在1×1011Bq/L HTO作用后峰强度随剂量增加在4 Gy时分裂为新的特征峰1 457 cm-1和1 470 cm-1，显示高剂量率的HTO辐射可能引起构象转移或共价键的断裂，从而导致脱氧核糖的干扰。因此，除了HTO β 射线的直接作用和自由基的间接作用，高剂量HTO还可以通过T-H的同位素交换作用导致脱氧核糖结构的变化和λ-dsDNA骨架的断裂。

对于T-H同位素交换反应，计算表明HTO对λ-dsDNA结构的作用主要发生在五元环的C2位置或CH2的C5位置，计算所获得的T-H交换TS示于图6。如图6所示，通过包括两个HTO分子的六元环氢迁移TS可以容易地进行T-H交换。先前关于HTO对受氚污染的泵油中T-H同位素交换过程的影响研究[55]提出，TS相对能量的显著降低可归因于从4变为6时成环状TS环应力的降低。经计算，T-H交换过渡态的相对能量在C2位为-28.35 kJ/mol，在C5位为-20.01 kJ/mol。该结果表明，当一定剂量的HTO作用于λ-dsDNA结构时，会发生T-H交换，从而破坏了λ-dsDNA结构。但是，获得的该能量远高于如上所述的N2…H2氢键裂解的能量，这与相对较高剂量的HTO会破坏λ-dsDNA结构的实验观察结果一致。

(a)——C2位，ΔE=-28.35 kJ/mol；(b)——C5位，ΔE=-20.01 kJ/mol

3 结 论

研究HTO的内照射辐射生物效应，就必须清楚地理解HTO在亚细胞结构中对生物大分子的损伤，以及这个损伤在生物空间、时间上的分布。细胞内HTO辐射能量的吸收和传递、分子的激发和电离、自由基的产生和化学键的断裂所涉及的生物物理和生物化学过程中的多种中间阶段均会产生λ-dsDNA的损伤。在此背景下，比较不同剂量率HTO引起的λ-dsDNA损伤可能有助于理解HTO的内照射辐射损伤的机制。

(1) 1×109Bq/L HTO在辐照时主要是电离辐射的间接作用为主，即由溶剂分子介导的电离辐射对溶解的λ-dsDNA起主要破坏作用。从实验结果可以看到，在1×109Bq/L HTO的低剂量(100～500 mGy)作用下出现的碱基和脱氧核糖的特征峰强度增加，可归因于水辐解的各种初级产物和次级产物导致的碱基对非堆积作用，并且它们对λ-dsDNA分子结构具有一定的选择性，主要破坏碱基间的氢键造成碱基不配对以及碱基结构的变化，从而造成碱基对较好的解叠加，最终导致λ-dsDNA的部分变性。而1×109Bq/L HTO的高辐射剂量(4～8 Gy)作用导致拉曼特征峰强度降低更明显，整个光谱的拉曼标记带分裂和展宽，表明通过自由基分子的长期作用更容易导致糖-磷酸主链或核碱基的局部变化。

(2) 1×1011Bq/L HTO 在低剂量短时间作用于λ-dsDNA产生的生物效应类似于γ射线，主要通过射线直接的电离作用或质子化作用导致碱基、特别是嘌呤环结构的破坏从而引起λ-dsDNA骨架的断裂。随着HTO辐照剂量的增加，辐照作用时间增长，同样出现了碱基对非堆积效应。

(3) 脱氧核糖的特征拉曼峰在2～8 Gy HTO辐照后呈现拉曼标记带的分裂、新拉曼峰的出现以及特征谱线的剂量依赖性消失，说明高剂量HTO的长期作用可产生H-T的同位素交换作用，能造成呋喃糖环构象转移或共价键的断裂，可引起λ-dsDNA骨架单链的断裂。