基于HPLC-ELSD法不同企业清热解毒口服液中山银花违规投料的研究与筛查

朱伟堃，王中如，牛红霞，周欣

(菏泽市食品药品检验检测研究院，山东 菏泽 274000)

0 引言

清热解毒口服液由石膏、金银花、玄参等十二味中药组成[1]，现收载于《中国药典》2015年版一部。具清热解毒之功效，用于热毒壅盛所致的发热面赤、烦躁口渴、咽喉肿痛；流感、上呼吸道感染见上述证候者。清热解毒口服液生产厂家众多，据统计，目前全国有211家生产企业。

清热解毒口服液方中所用金银花量较大，为134g每1000mL，与其同科植物山银花，两者长期混用[2,3]。《中国药典》2005年版一部按照“一物一名”的原则将金银花和山银花明确区分为两个品种[4]。两者虽为近缘植物，但药效与安全性不能一概而论[5-7]，李文沛等[8]发现与金银花相比，高剂量山银花灰毡毛忍冬会导致大鼠过敏。近年来，山银花产量大价格低，而金银花产量低价格高[9,10]，造成两者在市场中混用的情况无法得到解决。价格的差异，可能会导致部分生产企业存在为降低成本而不按处方进行投料的行为。两者在药材时相对较好区分[11]，但制成制剂后由于缺少方法，难以进行区别。

本文以山银花的特征成分灰毡毛忍冬皂苷乙[12,13]为指标，建立了清热解毒口服液中山银花的筛查方法。笔者收集到了全国16家生产企业的42批次样品，来自全国8个省份。通过建立的方法来评价和筛查各生产企业以山银花掺混金银花违规投料的情况。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260Ⅱ高效液相色谱仪-蒸发光散射检测器(安捷伦科技有限公司)，超声波清洗器(杭州超声波有限公司)，十万分之一电子天平(XS105型，METTLER TOLEDO)，超纯水仪(默克密理博)。

1.2 试药

灰毡毛忍冬皂苷乙对照品(批号：111814-201604，含量以94.4%计)、金银花对照药材(批号：121060-201608)、山银花对照药材(批号：121595-201202)均购自中国食品药品检定研究院。甲醇(色谱纯，默克公司)、乙腈(色谱纯，默克公司)、D101型大孔吸附树脂(国药集团化学试剂有限公司)

清热解毒口服液样品来自2020年山东省内市场流通抽样，具体样品收集情况见表1。

表1 样品收集情况

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18色谱柱 (4.6×250mm，5μm)，柱温：30℃，流速1.0mL/min以乙腈为流动相A，水为流动相B，按表2进行梯度洗脱。

表2 梯度洗脱表

蒸发光散射检测器检测，漂移管温度为60℃，雾化室温度 50℃，气体流速为 1.6L/min，进样量：对照品 5、20μl，供试品溶液 10μl。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品10.26mg置50mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，制成每1mL含灰毡毛忍冬皂苷乙0.1937mg的溶液，作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密量取本品10mL，加在D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.0cm，柱高为20cm)上，用水100mL洗脱，弃去水液，再用甲醇100mL洗脱，收集洗脱液，减压回收溶解至干(温度低于60℃)，残渣加50%甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

图1 典型液相色谱图

表3 样品测定结果

2.4 专属性试验

2.4.1 对照药材溶液的制备

分别称取金银花和山银花对照药材粉末0.5g，精密称定，置50mL量瓶中，加50%甲醇适量，超声处30min，放冷，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为金银花和山银花对照药材溶液。

2.4.2 山银花阴性模拟样品溶液的制备

取处方中所有药味，按处方比例制成缺山银花的阴性对照样品，按供试品溶液的制备方法，制成山银花阴性对照溶液。

2.4.3 山银花阳性模拟样品溶液的制备

取山银花替代金银花，处方中其他药味按处方比例，制成山银花阳性对照品，按供试品溶液的制备方法，制成山银花阳性对照溶液。

取上述金银花和山银花对照药材溶液、山银花阴性和阳性模拟样品溶液及“2.2”项下对照品溶液进行测定，结果显示金银花对照药材和山银花阴性模拟样品在与灰毡毛忍冬皂苷乙对照品色谱峰相应的位置上未出现保留时间一致的色谱峰，表明制剂中处方的药味及辅料对检测结果无干扰。典型图谱见图1。

2.5 检测限和定量限

精密量取对照品溶液，逐级稀释后注入液相色谱仪测定，以信噪比S/N=3时，此时的浓度为检测限；以S/N=10时，此时的浓度为定量限。灰毡毛忍冬皂苷乙的检测限为0.0194mg/mL，定量限为0.0388 mg/mL。

2.6 线性关系考察

精密吸取 2.1.2 项下对照品溶液各 3、5、10、15、20μl，注入液相色谱仪，分别测定峰面积。以灰毡毛忍冬皂苷乙进样量的自然对数为横坐标，峰面积的自然对数为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y=1.253X+3.674，R2=0.999。灰毡毛忍冬皂苷乙进样量在0.5811-3.8740μg之间，其自然对数与峰面积积分值自然对数呈良好的线性关系。

2.7 仪器精密度试验

精密吸取2.1.2项下对照品溶液20μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，取灰毡毛忍冬皂苷乙峰面积的自然对数，RSD为0.52%，表明仪器精密度良好。

2.8 耐用性试验

取同一供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，用Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)、Thermo C18(250mm×4.6mm，5μm)两种色谱柱试验，结果一致。

2.9 样品测定

根据灰毡毛忍冬皂苷乙的检测限(0.0194mg/mL)，故建议规定清热解毒口服液样品中灰毡毛忍冬皂苷乙的含量不得过0.025mg/mL。按照上述建立的方法对抽检的42批次清热解毒口服液进行检测，有2家企业的4批次样品检出灰毡毛忍冬皂苷乙，且均超出定量限，具体结果统计见表3，检出灰毡毛忍冬皂苷乙样品的典型色谱图见图1(F)。

3 讨论

3.1 检测条件的筛选

样品处理时查阅有关文献[14-15]，考察了直接稀释进样、正丁醇萃取、D101型大孔吸附树脂除杂等提取方法。直接稀释进样时目标峰附近杂峰较多，对于结果无法做出很好判断；正丁醇萃取时易发生乳化，且正丁醇萃取液减压干燥时间较长，不适合大批量处理。而大孔吸附树脂处理，可克服上述两种处理方法存在的困难。在流动相选择时，考察了乙腈-水，乙腈-0.4%冰醋酸溶液，乙腈-0.1%磷酸溶液等，最终选择了乙腈-水作为流动相，使得目标峰与邻近杂峰分离较好。

3.2 样品测定

通过上述测定结果可知，有2家企业的4批次样品检出了山银花特征成分灰毡毛忍冬皂苷乙，检出率9.5%，说明部分企业为降低成本，涉嫌以山银花掺混金银花进行违规投料，这对按处方进行投料的生产企业存在一定的不正当竞争。清热解毒口服液中山银花的违规使用问题仍不容乐观，现行法定标准不能有效控制企业的违规投料行为，增加清热解毒口服液中山银花检查项尤为必要。

最后，建议企业就山银花违规投料问题行自检，规范生产，并加强从业人员的有关培训。建议增加清热解毒口服液中山银花的检查项目，以提高产品的安全性。建议监管部门加强对生产企业从原料到成品的检查力度，提高企业的质量意识和质控水平，从而保障人民群众的用药安全。