当归补血汤对糖尿病足大鼠模型血管生成和炎症反应的影响

黄 强，常金霞，郑 硕，牛少辉，曹 乾，方毅娜，曹建春，张东萍

糖尿病足是糖尿病患者的严重并发症之一，可伴有肾病、神经病变、酮症酸中毒和(或)心肌病[1]。糖尿病足年发病率在2%左右，在糖尿病患者中发病率为4.5%～10.0%，其中约66%的糖尿病足患者需要住院治疗[2]。糖尿病足会直接导致患者生活能力下降，使生活质量恶化，并给医疗保健系统带来巨大的经济负担[3]。因此，开发促进糖尿病足创面快速愈合的治疗药物具有重要经济及社会价值。据报道显示，糖尿病患者创面愈合缓慢，与炎性细胞浸润并产生肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、IL-1β等炎性细胞因子密切相关[4-5]。此外，持续高血糖抑制缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)活性，从而降低血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)含量，导致糖尿病创面愈合延迟[6]。因此，抑制炎症反应，促进创面血管生成将是治疗糖尿病足的方向之一。当归补血汤的主要功效为补气生血，对产后血脱、劳伤血虚及疮疡溃后脓血过多等疾病具有良好的治疗效果[7-8]。因此，本研究应用链脲佐菌素诱导的糖尿病足大鼠模型，探究当归补血汤能否通过抑制炎症反应和促进血管生成加快糖尿病足创面的愈合。

1 材料与方法

1.1实验动物 选取体质量250～280 g的成年健康清洁级SD大鼠50只，均为雄性。饲养在温度为(24±1)℃、相对湿度为45%～55%、12 h明暗周期环境中，自由饮水和进食。SD大鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0011。

1.2实验试剂 链脲佐菌素(S8050，索莱宝)，血糖试纸(HEA-STP30，欧姆龙)，大鼠TNF-α ELISA检测试剂盒(ab236712，Abcam)，大鼠IL-6 ELISA检测试剂盒(ab234570，Abcam)，大鼠IL-1β ELISA检测试剂盒(ab255730，Abcam)，大鼠VEGF ELISA检测试剂盒(ab100786，Abcam)，Trizol试剂(15596-026，Invitrogen)，TIANScript RT KIT (KR104-02，天根生物)，SuperReal PreMix Plus (FP205，天根生物)；根据《内外伤辨惑论》，取黄芪30 g和当归6 g，研磨后加水熬制成汤剂备用，即为当归补血汤[9-10]。

1.3实验仪器 血糖仪(HGM-114，欧姆龙)，多功能酶标仪(Varioskan LUX，ThermoFisher)，实时荧光定量PCR仪器(HM-PCR，恒美)。

1.4方法

1.4.1糖尿病足模型制备：大鼠常规喂养1周后，更换为高脂饲料继续喂养1个月，禁食1 d，腹腔注射含1%链脲佐菌素的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(pH=4.2，0.1 mol/L)[1]，注射剂量根据55 mg/kg计算，对照组注射同等体积的缓冲液。于第3天和第5天尾静脉取血，检测空腹血糖，若血糖值均>16.7 mmol/L则造模成功[6]。选取40只造模成功的糖尿病大鼠模型和10只对照大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥钠，注射剂量根据0.3 ml/100 g计算，于右侧足部背面造3 mm×3 mm矩形创口。

1.4.2分组与给药：造模成功的糖尿病足大鼠模型随机分为模型组、低剂量组(生药浓度2 g/kg)、中剂量组(生药浓度4 g/kg)、高剂量组(生药浓度8 g/kg)，每组10只。当归补血汤给药方式为灌胃，每天1次，给药量以1 ml/100 g计算。中剂量组给药剂量(生药浓度4 g/kg)是根据人使用量等剂量转换，以此剂量为基础，低剂量组减少50%，高剂量组增加1倍，观察治疗效果是否有剂量依赖效应。对照组和模型组的灌胃药物替换为生理盐水。给药1周后处死动物，检测相关指标。

1.4.3足部创面面积计算：在实验终点对创面愈合情况进行拍照，应用IPP 6.0软件测量并计算创面面积[3]。

1.4.4ELISA检测：大鼠内眦取血，分离血清约300 μl，实验步骤严格参照ELISA试剂盒说明书，分别检测大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β和VEGF含量。

1.4.5qRT-PCR检测：采用实时荧光定量PCR检测新生肉芽组织中的IL-6、TNF-α、IL-1β和VEGF mRNA表达水平。取大鼠足部新生肉芽组织，面积约10 mm2，于液氮中冻存，采用Trizol法提取肉芽组织总RNA。反转录为cDNA，反转录参数如下：95℃预变性15 min，95℃退火10 s，58℃延伸30 s，共计40个循环。以β-actin作为内参基因，IL-6、TNF-α、IL-1β和VEGF mRNA表达水平采用2-ΔΔCt法计算。实验均重复3次，取其平均值。IL-6、TNF-α、IL-1β、VEGF和β-actin的引物序列见表1。

2 结果

2.1当归补血汤对糖尿病足大鼠足部创面愈合的影响 给药1周后，各组足部创面愈合情况见图1。对照组创面已结痂，基本愈合，创面面积(3.23±0.42)mm2；模型组创面部位红肿，远未达到愈合状态，创面面积(17.15±2.31)mm2；低、中、高剂量组创面面积分别为(13.62±1.26)mm2、(9.44±0.83)mm2、(5.35±0.71)mm2，红肿程度逐渐减轻。模型组创面面积大于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。低、中、高剂量组创面面积均小于模型组，且随着给药剂量增大，创面面积逐渐变小，组间比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见图2。

图1 5组大鼠足部创面愈合情况

图2 5组大鼠足部创面面积比较

2.2当归补血汤对糖尿病足大鼠血清炎性细胞因子的影响 模型组血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。低、中、高剂量组血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量均低于模型组，高剂量组低于中、低剂量组，中剂量低于低剂量组，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见表2和图3。

图3 5组大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量比较

表2 5组大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量

2.3当归补血汤对糖尿病足大鼠血清VEGF含量的影响 对照组血清VEGF含量为(37.06±3.21)ng/L，模型组为(24.52±2.16)ng/L，低、中、高剂量组分别为(32.76±3.43)ng/L、(39.05±5.23)ng/L、(53.70±7.84)ng/L。模型组血清VEGF含量低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。低、中、高剂量组血清VEGF含量均高于模型组，高剂量组高于中、低剂量组，中剂量组高于低剂量组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图4。

图4 5组大鼠血清VEGF含量比较

2.4当归补血汤对糖尿病足大鼠新生肉芽组织TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表达的影响 模型组新生肉芽组织TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表达高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；低、中、高剂量组新生肉芽组织TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表达均较模型组下降，高剂量组低于中、低剂量组，中剂量组低于低剂量组，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见表3和图5。

图5 5组大鼠新生肉芽组织TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表达水平比较

表3 5组大鼠新生肉芽组织TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表达水平

2.5当归补血汤对糖尿病足大鼠新生肉芽组织VEGF mRNA表达的影响 对照组新生肉芽组织VEGF mRNA表达为2.85±0.12，模型组为0.67±0.06，低、中、高剂量组分别为0.89±0.08、1.23±0.10、2.24±0.13。模型组新生肉芽组织VEGF mRNA表达低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；低、中、高剂量组新生肉芽组织VEGF mRNA表达均较模型组升高，高剂量组高于中、低剂量组，中剂量组高于低剂量组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图6。

图6 5组大鼠新生肉芽组织VEGF mRNA表达水平比较

3 讨论

糖尿病足是糖尿病的严重并发症，在全世界范围内，是非创伤性截肢的主要原因，10%～15%的患者出现足部溃疡[11-12]。而大多数糖尿病足患者不能及时治愈或愈合欠佳，常导致严重的并发症，如皮肤、软组织、骨骼或全身感染，甚至截肢[13-14]。造成糖尿病足创面愈合延迟的因素包括血糖水平高、胰岛素抵抗、胶原蛋白沉积、血管生成障碍、血液供应减少和浸润反应延迟等[2]。另外，创面部位炎性细胞浸润、促炎细胞因子(如TNF-α、IL-6、IL-1β)水平升高在糖尿病足的发展过程中起着重要作用[4-5]。基于一项前瞻性临床研究发现，在糖尿病相关的视网膜病变中，血清IL-1β、TNF-α和VEGF浓度对视网膜病变的发生和发展具有重要影响，并且其含量与疾病的严重程度呈正相关[15]。还有研究表明，糖尿病引起的并发症多与炎性细胞因子相关，抑制机体炎症反应或是治疗糖尿病并发症的有效手段[16]。此外，有研究观察到在糖尿病足综合征患者中血管生成能力不足[17]。原因是糖尿病患者持续的高血糖水平会使HIF-1α失活，抑制VEGF的产生，导致糖尿病足创面愈合延迟[6]。一项队列研究显示，糖尿病足患者血清VEGF的含量高于对照组，但低于糖尿病对照者，并且VEGF-A的浓度增加与糖尿病足风险降低有关[18]。因此，抑制炎性细胞因子，增加创面血管的生成将是治疗糖尿病足重要方法。

当归补血汤的主要作用为补气生血，主要用于产后血脱、劳伤血虚及疮疡溃后脓血过多等治疗。在临床中，已有中医学者将当归补血汤用于糖尿病足的治疗，能够促进溃疡创面的修复[7-8]。在糖尿病足溃疡大鼠模型中，黄芪可有效减小创面面积，抑制炎症反应并促进成纤维细胞的增殖[19]。另外一项研究也显示，当归补血汤能有效改善链脲佐菌素诱导的糖尿病足大鼠模型肢端坏疽[20]。本研究结果显示，当归补血汤能有效降低糖尿病足大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量，以及创面新生肉芽组织TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA的表达水平，从而抑制炎症反应，促进创面的愈合。此外，当归补血汤在血管生成方面能够发挥重要作用，可通过VEGF途径促进肝纤维化大鼠模型、心肌梗死大鼠模型和脑缺血再灌注损伤大鼠模型新生血管的生成[21-23]。但是，当归补血汤能否在糖尿病足大鼠模型中发挥同样的促进血管生成作用尚未证实。本研究发现，当归补血汤可提高糖尿病足大鼠血清VEGF含量，并促进新生肉芽组织VEGF mRNA表达。因此，糖尿病足大鼠创面愈合可能与新生血管有关。

本研究也存在一定的不足，如药物干预时间稍短。此外，糖尿病足溃疡形成机制非常复杂，除炎症反应和新生血管生成外，还可能涉及其他信号传导通路。因此，针对糖尿病足溃疡发病的机制，以及新治疗手段和药物的开发还需要深入探索。

综上所述，当归补血汤能有效下调糖尿病足大鼠模型TNF-α、IL-6和IL-1β的表达，上调VEGF表达；通过抑制炎症反应和促进新生血管生成加快糖尿病足创面的愈合。