深圳特区大米中黄曲霉毒素B1的检测及统计分析

李晓娜，田慧勇，杨晓夏*，曹涛，李森

（1.深圳市通量检测科技有限公司，广东 深圳 518102；2.广东省检迅检测科技有限公司，广东 东莞 523843；3.深圳市汇知科技有限公司，广东 深圳 518101）

黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）是黄曲霉、寄生曲霉和野曲霉等真菌产生的一类次生代谢产物[1]。在结构上AFs在紫外光下发出荧光的颜色不同，是二呋喃香豆素的衍生物[2]。根据荧光的颜色AFs分为黄曲霉毒素B1和B2（AFT B1，AFT B2）（图1-1），G1和 G2（AFT G1，AFT G2）[3，4]。黄曲霉毒素M1和M2（AFT M1，AFT M2）在牛奶中存在，是AFT B1和AFT B2的代谢产物；AFT B1的另一类代谢产物是黄曲霉毒素Q1（AFT Q1）和黄曲霉毒素醇[5]。黄曲霉毒素对易感实验动物和家畜具有显著的毒性和致癌性，对人体具有急性毒性和慢性肝癌效应，是目前研究最为深入的真菌毒素类群，是一级致癌物[6]。

图1 -1 AFT B1、AFT B2的结构图

不同国家对AFT B1的设定范围不同，基本也都在1～20 μg·kg-1之间[7]。欧盟法规规定：谷物中AFT B1含量最大值为2 μg·kg-1，其衍生品的最高限量为4 μg·kg-1，婴儿食品最为严格，为 0.1μg·kg-1[8，9]。中国标准 GB 2761-2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》中规定，大米中AFT B1最高限量为10μg·kg-1[10]。大米由于运输或存储不当易滋生霉菌从而产生霉菌毒素[11]。

供给深圳的大米主要来自黑龙江五常、辽宁灯塔及全国各地等优质原粮基地，在东北、安徽等多个优质产区设立示范田，同时还包括广西巴马等对口帮扶等地区，大米完成加工后将被端上2000多万深圳人的餐桌。供给大米要从生产基地、水土环境、生产过程、可追溯以及产品质量五大因素考量，还要经过石机清理杂质，抛光过筛，色选机等多项工序。品控人员要对加工后的大米进行7道工序的4次检测，将重金属、水分含量等控制在标准之内，最终经过严格评价满足供深食品标准体系要求，才能被端上深圳市民的餐桌。本研究对深圳特区抽样的大米进行检测，通过对不同年度和不同抽样场所的大米中AFT B1含量综合分析，客观地分析评价深圳特区大米中AFT B1含量总体情况。

1 材料与方法

1.1 样品来源

政府部门委托抽样送检，抽样情况见表1。

表1 2018～2020年深圳特区大米抽样情况

1.2 主要仪器和试剂

高效液相色谱仪，型号：e2695，购自Waters公司；荧光检测器，型号：FLD-3400 RS，购自Thermofisher公司；C18色谱柱，型号：Syncronis C18 250 mm×4.6 mm×5 μm，购自Thermofisher公司；AflaCLEANTM黄曲霉总量免疫亲和柱（体积：3 mL），型号：10514，购自德国LCTech公司。

甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、正己烷（色谱纯）、三氟乙酸（析纯）、碳酸钠（分析纯）、碳酸氢钠（分析纯）均购自阿拉丁公司。AFT B1标准品（CAS号：162658、纯度≥98%）购自北京中科质检生物技术有限公司。本试验用水为GB/T 6682规定的一级水。

1.3 检测方法

1.3.1 样品前处理

(1)大米：高速粉碎机将其粉碎，过粒径小于2 mm孔径的试验筛，混均匀缩分每袋10 g，密封保存。

(2)样品提取：称取大米5 g试样（精确至0.01 g），置于50 mL离心管，加入20.0 mL乙腈-水溶液（体积比84∶16），涡旋混匀，置于摇床振荡20 min，在600 r / min离心10 min，取上清液备用。

(3)样品AFT 固相净化柱净化。

(4)净化柱平衡：将净化柱于室温中放置15 min以上，平衡至室温。

(5)过柱：取5～50 mL的样品提取稀释液上AflaCLEANTM净化柱，在过柱中可以对净化柱进行加压或抽真空，但必需保证柱流速1～2滴/秒。该净化柱最大上样量以AFT B1计为150 ng。

(6)清洗：10 mL H2O清洗净化柱。

(7)除水：抽真空除去残余H2O。

(8)洗脱：用1 mL甲醇洗脱柱洗2次，第一次加入的甲醇需在柱子中保持5 min进行活化柱子。

(9)将洗脱液浓缩。

(10)衍生：用移液管准确吸取4.0 mL净化液，置入离心管后在50℃下用氮气吹干，先后加入20 μL正己烷和10 μL三氟乙酸，涡旋30 s，在40℃的恒温箱中放置15 min后，用50℃氮气将衍生液吹干，用初始流动相定容1.0 mL，涡旋30 s，过 0.2 μm滤膜后进样。

1.3.2 色谱条件

流动相分为A相（蒸馏水）、B相：乙腈-甲醇溶液（体积比50：50）；梯度洗脱：24%B（0～6 min），35%B（8.0～10.0 min），10%B（10.2～11.2 min），24%B（11.5～13.0 min）；色谱柱为C18柱，柱长250 mm，柱内径4.6 mm，填料粒径5.0 μm；流速为1.0 mL / min；柱温40℃；进样体积为50 μL；检测激发波长为360 nm；发射波长为40 nm。

1.3.3 样品测定

标准工作溶液浓度分别为0.01 μg/L、0.05 μg/L、0.10 μg/L、0.20 μg/L、0.40 μg/L、0.80 μg/L、1.50 μg/L依次进样检测，以峰面积为纵坐标，AFT B1浓度为横坐标作图，得到标准曲线回归方程。将待测样液进样分析，超过标准曲线的最大浓度样品进行稀释后再进样分析。空白试验则不称取试样，按照1.3.1步骤进行空白实验。

1.3.4 结果分析

大米中AFT B1的含量按以下公式计算：

其中 X为大米中AFT B1的含量（μg/kg）；ρ：进样溶液中AFT B1按照外标法在标准曲线中对应的浓度（μg/L）；V1：试样提取液体积（mL）；V3：净化液的最终定容体积（mL）；V2：净化柱净化后的取样液体积（mL）；m：试样的称样量（g）。

1.4 统计学分析

用Statistics SPSS 22.0对检验数据进行分析，分别对2018～2020年3年和四类抽样场所采用单因素方差分析。

图1 AFT B1标准溶液的HPLC图

图2 大米样品中AFT B1的HPLC图

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制及初筛结果

AFT B1标准溶液的HPLC图谱见图1，其保留时间约为10.50 min，按照4.2中的方法将AFT B1标准溶液注入HPLC中，测定待测物质AFT B1的信号响应值，以AFT B1的标准溶液浓度为横坐标，AFT B1响应信号值的比值为纵坐标，绘制标准曲线。按其检出限公式D.L.=3SD/k计算得出AFT B1的检出限为0.03 μg/kg。对浓度为10 μg/L的AFT B1标准溶液进行11次平行测定，其相对标准偏差RSD值不大于0.9%。说明该试验满足大米中AFT B1的分析要求。其线性方程为y=17256x-10325（R2= 0.9999）。

按照步骤将202批次大米处理后进入HPLC—荧光检测分析。本次202批次样品大米中的AFT B1含量均未超标，实际大米样品谱图见图2。

2.2 2018～2020年度深圳特区大米样品中AFT B1含量统计分析

表2中可见2018年深圳特区大米中AFT B1的含量为2.537 μg·kg-1、2019 年为 2.621 μg·kg-1、2020 年为 2.455 μg·kg-1，三组数据的相差绝对值分别为 0.084 μg·kg-1、0.166 μg·kg-1和0.082 μg·kg-1，差值并不明显，经方差分析得到其概率P值为0.451，明显大于设置的显著性水平0.05（表3）。该分析表明在2018年至2020年这三年间深圳特区大米中的AFT B1含量并无显著性差异。

表2 2018～2020年深圳特区大米样品AFT B1含量统计分析表

表3 2018～2020年深圳特区大米样品AFT B1含量的方差分析表

2.3 深圳特区四类抽样场所的大米中AFT B1含量统计分析

我们选择四类抽样地点分别是农贸批发市场、大超市、中小超市和大米企业。由表4可知农贸批发市场46批次的大米样品平均AFT B1含量为4.441 μg·kg-1，中小超市为2.135 μg·kg-1、大超市为 2.049 μg·kg-1、大米企业为 1.527 μg·kg-1，其相差最大值为2.914 μg·kg-1。经SPSS方差分析得到显著性水平P＜0.05，说明四个采样场所间存在着显著性差异，具有统计学意义（见表5）。

表4 四类抽样地点大米样品AFT B1含量统计分析表

表5 四类抽样地点大米样品AFT B1含量的方差分析表

3 结论

2018～2020 连续三年202批次大米样品进行检测发现，AFT B1 含 量 均 值 分 别 为 2.537μg·kg-1、2.621μg·kg-1、2.455μg·kg-1，低于GB 2761-2017中规定的标准限量10 μg·kg-1，AFT B1含量均值在年份之间的差异并不显著，且没有发现超标样品。对四类不同场所抽样检测发现AFT B1含量均值由高到低分别为：农贸批发市场4.441μg·kg-1、中小超市2.135 μg·kg-1、大超市 2.049 μg·kg-1、企业 1.527 μg·kg-1。抽检地点之间差异显著，其中农贸批发市场AFT B1含量均值明显高于其他三类抽样地点，抽样中发现，农贸批发市场店铺空间有限，仓库位置不佳，且仓库简陋，通风设施和温度控制设施不完善，加之深圳气候湿润，使大米处于阴湿环境易受黄曲霉污染。综上所述，深圳特区大米中黄曲霉毒素B1污染程度相对较低，可放心食用。