丙泊酚调控PI3K/AKT信号通路对肺癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响

谢圆媛，胡海峰，赵 莉，薛 鹏

近年来，肺癌的发病率逐年上升，已经成为最常见的恶性肿瘤[1]。我国肺癌的发病率及病死率均位居恶性肿瘤之首[2]。虽然针对肺癌的诊断和治疗方法不断改进，但其存活率并无明显提高，且临床预后效果差。PI3K/AKT信号通路在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用[3]，能够促进细胞增殖和肿瘤转移，并抑制细胞凋亡，也与肿瘤的治疗及预后密切相关[4]。约90%的非小细胞肺癌细胞株存在PI3K/AKT信号通路的过度激活，以PI3K/AKT信号通路为靶标的新药研发越来越受到重视[5]。丙泊酚是临床上常用的麻醉药物，近年来有研究发现其具有抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的作用[6]。本课题将探究丙泊酚能否通过PI3K/AKT信号通路对肺癌细胞的增殖、迁移与凋亡产生影响，并进一步探讨其作用机制，为临床上治疗肺癌提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1实验材料 人肺癌A549细胞株(CQH005)购自上海科学院细胞研究所。24只4～6周龄的雄性A/J小鼠(N000018)由延安大学医学院动物研究中心提供，实验动物许可证号：SCXK(陕)2019-003。丙泊酚购自上海源叶生物科技有限公司，RPMI-1640培养基、胎牛血清和Trizol试剂均购自美国Abcam公司，PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis试剂盒和TB GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ试剂盒购自日本TaKaRa公司，Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，HE染色试剂盒和RIPA裂解液均购自北京索莱宝科技有限公司，PTEN、PI3K、p-AKT、AKT、mTOR、GAPDH多克隆抗体和山羊抗兔(鼠)IgG二抗均购自美国Cell Signaling Technology公司，PVDF膜购自美国Millipore公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养：A549细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养，传代时用0.25%胰蛋白酶进行消化，每2天更换1次培养基，以保证细胞生长所需的营养成分。

1.2.2细胞分组：根据细胞培养基中添加丙泊酚浓度的不同[7]，将细胞分为control组(未添加丙泊酚)、pL组(添加丙泊酚1.5 μg/ml)和pH组(添加丙泊酚2.2 μg/ml)。A549细胞以每孔1×105个接种于24孔板，待细胞融合度达60%时，按照上述分组分别加入不同浓度的丙泊酚，24 h后结束培养，收集各组细胞进行后续实验。

1.2.3克隆形成实验：培养24 h后的各组细胞按每孔1×103个接种于60 mm细胞培养皿中。培养14 d后用结晶紫溶液对细胞进行染色，计数含有≥50个细胞的集落，并用显微镜拍摄代表性细胞集落并进行统计。

1.2.4细胞划痕实验：培养24 h的各组细胞以2×104/ml接种于12孔培养板中，待细胞融合度达90%时，用10 μl无菌枪头沿培养皿底直线划痕，形成间隙。应用PBS重复洗涤3次，再加入不含血清的培养基，放入培养箱中继续培养。24 h后在显微镜下观察细胞愈合程度并拍照，测量细胞间的划痕距离。

1.2.5流式细胞术：培养24 h后的各组细胞用冷PBS清洗2次，用缓冲液重悬，调整细胞密度为1×105/ml。具体操作按照Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6qRT-PCR检测：Trizol试剂提取各组细胞的总RNA。使用紫外分光光度计检测总RNA的纯度和含量，并将每个配对的样品调节至相同浓度。使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis试剂盒将提取的RNA反转录成cDNA；使用TB GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ试剂盒进行qRT-PCR检测。使用StepOnePlus实时PCR系统完成实验后，采用2-ΔΔCt法分析数据。实验相关引物序列见表1。

表1 PTEN、PI3K、AKT、mTOR和GAPDH的引物序列

1.2.7Western blot检测：RIPA裂解液提取各组细胞的总蛋白，并通过BCA方法进行定量，样品经变性后进行上样。按照实验步骤进行电泳-转膜-封闭(5%脱脂奶粉)-加一抗孵育[PTEN抗体(1∶1000)、PI3K抗体(1∶1000)、p-AKT抗体(1∶1000)、AKT抗体(1∶1000)、mTOR抗体(1∶1000)和GAPDH抗体(1∶2000)，4℃过夜]-加二抗孵育[山羊抗兔IgG抗体(1∶4000)或山羊抗鼠IgG抗体(1∶4000)，室温1 h]-显影曝光。应用Image-Pro Plus图像分析系统对蛋白条带灰度值进行分析。

1.2.8小鼠移植成瘤实验：采用苯并芘诱导小鼠肺癌模型[8]，选取雄性A/J小鼠，经右侧胸壁穿刺肺内注射50 μl苯并芘-玉米油溶液(苯并芘浓度为20 mg/ml)，每周1次，共注射4次。4周后，HE染色验证造模是否成功。造模成功的24只小鼠被随机分为c组、p1组(腹腔注射丙泊酚20 mg/kg)和p2组(腹腔注射丙泊酚50 mg/kg)[9]，每组8只。c组腹腔注射0.9%氯化钠注射液，p1组和p2组腹腔注射相应剂量的丙泊酚，每天给药1次、连续给药28周。末次给药2 h后处死小鼠，取全肺组织，体视显微镜测量各组肺部肿瘤的数量及大小并拍照。

2 结果

2.1丙泊酚对A549细胞增殖的影响 克隆形成实验结果显示，与control组比较，pL组和pH组均能抑制A549细胞增殖能力，差异有统计学意义(P<0.05)；且呈剂量依赖性。见图1。

图1 丙泊酚对A549细胞增殖的影响(结晶紫染色×40)

2.2丙泊酚对A549细胞迁移的影响 细胞划痕实验结果显示，与control组比较，pL组和pH组均能抑制A549细胞迁移能力，差异有统计学意义(P<0.01)；且呈剂量依赖性。见图2。

图2 丙泊酚对A549细胞迁移的影响

2.3丙泊酚对A549细胞凋亡的影响 流式细胞术检测结果表明，与control组比较，pL组和pH组能促进A549细胞的凋亡，差异有统计学意义(P<0.01)；且呈剂量依赖性。见图3。

图3 丙泊酚对A549细胞凋亡的影响

2.4丙泊酚对A549细胞PTEN、PI3K、AKT及mTOR mRNA和蛋白表达的影响 qRT-PCR和Western blot检测结果显示，与control组比较，pL组和pH组能够抑制A549细胞中PI3K、AKT、mTOR mRNA和蛋白的表达以及AKT的磷酸化程度，提高PTEN mRNA和蛋白的表达，差异有统计学意义(P<0.01)；且呈剂量依赖性。见图4。

图4 丙泊酚对A549细胞PTEN、PI3K、AKT及mTOR mRNA和蛋白的表达情况

2.5丙泊酚对小鼠肺部肿瘤生长的影响 用苯并芘诱导A/J小鼠复制肺癌模型，HE染色确定模型制备成功，并给予丙泊酚腹腔注射处理、连续给药28周，通过对小鼠肺部肿瘤数量及大小测量发现，与c组比较，p1组和p2组肿瘤数量显著减少、肿瘤体积显著减小，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见图5。

图5 丙泊酚对A/J小鼠肺部肿瘤生长的影响

3 讨论

肺癌是一种临床常见的恶性肿瘤，发病率和病死率较高。男性肺癌患者的发病率和病死率在各种恶性肿瘤中居首位，且临床预后效果差[10]。据相关数据显示，每年新增肺癌患者约182.5万，因肺癌而死亡的患者约159万[11]。临床上80%～85%的肺癌患者为非小细胞肺癌，而且有80%的患者在确诊时就已经属于中晚期，只能进行化放疗、靶向治疗或者中医药治疗[12-14]。因此，寻找新的肺癌治疗药物至关重要。

PI3K/AKT信号通路与肿瘤细胞的生长和转移有着高度的相关性，肿瘤细胞会使该通路异常激活，从而促进肿瘤细胞的增殖和转移[15]。AKT在PI3K/AKT信号通路中占重要地位，其可以通过磷酸化作用直接或间接影响下游靶蛋白[16-17]。而且PI3K/AKT信号通路在多种肿瘤组织中呈现高表达，如肺癌、乳腺癌、卵巢癌、鼻咽癌等[18]。

丙泊酚作为临床上应用最为广泛的全身麻醉药物，可通过激活内质网应激介导多种癌细胞的凋亡[19]。相关研究表明，丙泊酚还具有抗炎、抗氧化等作用[20]，而且大量研究证实丙泊酚还具有抑制肿瘤细胞转移的作用，但其具体机制尚不完全清楚[21-22]。本实验探讨了丙泊酚对肺癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响，结果表明，与control组比较，pL组和pH组均能抑制A549细胞的增殖能力和迁移能力，且能促进A549细胞的凋亡；以上实验数据表明丙泊酚能够抑制肺癌细胞的增殖、迁移，促进肺癌细胞的凋亡。

本实验进一步探讨了PI3K/AKT信号通路在肺癌中的作用，以及丙泊酚对PI3K/AKT信号通路的影响，结果显示，与control组比较，pL组和pH组均能抑制A549细胞中PI3K、AKT和mTOR mRNA和蛋白的表达，提高PTEN mRNA和蛋白的表达。以上实验结果表明丙泊酚能够抑制PI3K/AKT信号通路的激活。最后，本研究进行了小鼠移植成瘤实验，结果发现，丙泊酚抑制了肿瘤的生长，小鼠肺部肿瘤的数量显著减少、肿瘤体积也显著减小，说明丙泊酚能够抑制小鼠肺部肿瘤的生长。因此，丙泊酚可能通过抑制PI3K/AKT信号通路来抑制肺癌细胞的增殖、迁移，并促进肺癌细胞的凋亡。

综上所述，丙泊酚能够抑制肺癌细胞的增殖、迁移，促进其凋亡，还能抑制小鼠肺部肿瘤的生长，其机制可能是通过增加PTEN的表达，抑制PI3K/AKT信号通路激活实现的。但丙泊酚的作用机制是否还有其他途径尚需要进一步研究证实。