蚯蚓粪对柑桔幼苗抗草甘膦胁迫的影响

梁敬崎，姜 蕾，王冰洁，潘 波，林 勇 ，崔玉东

(1 黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江大庆，163319；2 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室，海口，571101)

柑桔目前是我国栽培面积及产量最大的水果[1]，柑桔产业是我国南方农业产业的主导产业之一，也是我国柑桔主产区农民增收的主要来源[2]。然而，在我国南方地区高温高湿的气候条件下，杂草生长旺盛，除草剂用量大，而草甘膦凭借剂型较多且高效、广谱、适用范围极广的特点成为目前桔园除草的首选除草剂[3-5]。草甘膦在柑桔园里大量使用[5-7]，源源不断地进入土壤，不仅造成土壤污染和生态失衡，而且药害问题(影响柑桔生长，造成果实品质和产量下降[8])也日益显现。如何降低草甘膦对柑桔树的生物可利用性，从而降低其对农作物造成的药害，提高果实品质和食品安全，已经是柑桔生产需要直面的课题。已有的研究发现，蚯蚓粪不仅是营养丰富的有机肥，而且能够显著改变土壤中残留有机污染物的环境行为[9]，增强农作物植株的抗逆能力[10]。笔者在前期研究的基础上，对比研究了施用蚯蚓粪与否，土壤残留草甘膦对柑桔幼苗的生物有效性和生物毒性效应差异，以期为草甘膦污染土壤的修复与高效利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

Acquity UPLC I-class 型超高效液相色谱仪。XEVO TQ-MS 型三重四极杆串联质谱仪。色谱柱：Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)、 Waters HSS T3 (100 mm×2.1 mm,1.8 μm)。固相萃取小柱：C18(500 mg 6cc)、HLB(200 mg 6cc)。以上均购于美国Waters。甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯，美国Fisher)，丙酮、硼酸钠、无水乙酸铵(分析纯，广东化学试剂厂)，9-芴基甲基三氯甲烷(99.0%，美国Sigma)，草甘膦标准品(98.6%，德国DR)，试验用水(超纯水系统制备)。

试验用未污染表层土取自海南省儋州市国家农业科技园区(19.50°N, 109.48°E)。蚯蚓粪取自蚯蚓养殖场。土壤和蚯蚓粪样品经风干，去除枯枝等，研磨过3 mm筛备用。

1.2 方法

1.2.1 柑桔幼苗培养 预试验1：设计7个浓度的草甘膦处理，分别为0、0.15、0.45、1.35、4.05、12.15和36.45 mg/kg。在12.15 mg/kg时，抗氧化酶和丙二醛含量有明显的变化，同时，基于田间草甘膦实际施用量及草甘膦在农田产生的累积残留情况[11]，决定选取12.15 mg/kg为最适的草甘膦浓度。

预试验2：设计系列含量的蚯蚓粪处理，分别为2.5%、5%、10%和15%，草甘膦含量依据预试验1确定为12.15 mg/kg。种植柑桔幼苗的生长情况显示，5%处理组与10%处理组无显著差异。综合考虑经济性和实用性，选取了5%蚯蚓粪为试验浓度。

正式试验：依据预试验1和预试验2，设计了4个处理——CK，空白对照，即土壤不含草甘膦和蚯蚓粪；EWC，土壤中添加蚯蚓粪，含量为5.0%(质量百分比)；Gly，土壤中添加草甘膦，含量12.15 mg/kg；Gly+EWC，土壤中同时添加蚯蚓粪和草甘膦，含量分别为5.0%和12.15 mg/kg。在1 L的塑料罐中，装有1 200 g的上述不同处理的土壤，选取萌芽一致的红桔种子播种到塑料罐中(每罐5株)，1罐为小区，每个处理重复5次。放置在人工气候箱里培养，调节湿度为70%，明/暗循环(14/10 h，27/22 ℃，光照强度300 μmol·m-2·s-1)，每天定时补充水分。培养6周后，采集样品进行相关检测。

1.2.2 土壤和植物组织中草甘膦检测 土壤中草甘膦的检测：将土壤样品按照固液比1∶5(m/v)与0.6 mol/L的KOH混合，超声提取40 min，4 025 g离心20 min，取上清液，过HLB固相萃取小柱，收集流出液，取1 mL，参照Aparicio等[12]的方法进行衍生化，通过0.22 μm膜过滤，使用Waters Acquity UPLC I-class型超高效液相色谱/XEVO TQ-MS型三重四极杆串联质谱仪进行检测。

植物组织中草甘膦的检测：取0.5 g植物组织，经液氮研磨后与5 mL超纯水混匀，加入2 mL二氯甲烷，超声提取30 min，4 025 g离心20 min，取上清液。后续步骤与上述土壤中草甘膦的检测相应操作一致。

1.2.3 柑桔幼苗生长量测定 用皮尺测量从根基部到植株顶部的长度作为株高；量取主根长度作为根长[13]。新鲜的植物样品在105 ℃恒温烘箱中干燥20 min，80 ℃烘干48 h，称量干质量。

1.2.4 柑桔叶片叶绿素含量测定 取0.2 g新鲜叶片剪碎，浸泡在15 mL的丙酮∶无水乙醇∶超纯水为4.5∶4.5∶1的浸提液中，避光浸提24 h，用分光光度计测定上清液中总叶绿素含量[10]。

1.2.5 柑桔组织膜脂过氧化水平测定 参照Wang等[14]方法，通过测定硫代巴比妥酸反应底物(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)来表征植物膜脂过氧化水平。新鲜的柑桔幼苗组织样品于1 g/L三氯乙酸(TCA)中研磨匀浆，10 000 g 离心30 min，取上清液加入等体积5 g/L的硫代巴比妥酸(TBA)，混合后沸水浴中保温30 min，迅速用冰水浴降温至室温，最后4 ℃、15 000 g 离心5 min。用分光光度计分别测定上清液在450、532和600 nm处的吸光度值，按公式：C (μmol/L)= 6.45 (A532-A600)-0.56A450计算TBARS含量。

1.2.6 柑桔组织抗氧化酶活力测定 参照Jiang等[10]的方法，将新鲜的柑桔幼苗叶和根经50 mmol/L 磷酸钠缓冲提取液匀浆提取获得粗酶液。采用考马斯亮兰法[15]测定蛋白质含量。超氧化物歧化酶(SOD，EC 1.15.11)活力测定采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法。过氧化氢酶(CAT，EC1.11.1.6)活力测定采用紫外吸收法。过氧化物酶(POD，EC 1.11.1.7)活力测定采用愈创木酚比色法。谷胱甘肽S-转移酶(GST，EC 2.5.1.18)能催化GSH与CDNB结合，其结合产物的光吸收峰波长为340 nm，通过测定340 nm波长处吸光度上升速率即可计算出GST活性。

2 结果与分析

2.1 土壤中草甘膦的生物有效性

如表1所示，存在蚯蚓粪(Gly+EWC)时，土壤和柑桔幼苗中草甘膦的残留量均较单施草甘膦(Gly)处理组有所下降，尤其是土壤中草甘膦含量下降了44.85%(p<0.01)。分析认为，由于蚯蚓粪不仅可以为土壤中微生物提供丰富的营养，能够增强其对有机污染物的代谢能力[16]，而且蚯蚓粪本身富含多种微生物群落和酶能够分解有机污染物[17]，使土壤中残留的草甘膦减少，从而土壤中残留的可供柑桔幼苗吸收富集的草甘膦总量明显下降。然而，柑桔幼苗中草甘膦的积累量(含量)并未发生大幅下降，尤其根系中未发生显著性变化，从草甘膦的生物富集系数(Bioconcentration factors,BCF)[9]来看，添加蚯蚓粪处理(Gly+EWC)柑桔树幼苗地上部分的BCF值反而比未添加蚯蚓粪处理(Gly)的增加77.61%，同样地，根的BCF值也增加78.49%。其原因可能是蚯蚓粪中高含量的速效磷会与草甘膦竞争土壤吸附位点，促进草甘膦的解吸，使其生物可利用性增强，从而更易于被植物吸收富集[18]。

表1 蚯蚓粪作用下草甘膦在土壤和柑桔树幼苗中的蓄积情况

2.2 柑桔幼苗的生长

如图1所示，不同处理柑桔幼苗生长由强到弱的排序如下：蚯蚓粪处理(EWC)>蚯蚓粪+草甘膦处理(Gly+EWC)>对照(CK)>草甘膦处理(Gly)。在没有草甘膦胁迫条件下添加蚯蚓粪(EWC)，使柑桔幼苗的生长显著优于对照，株高及其干质量分别增长了28.72%和25.00%，根长(主根)及其干质量也分别为对照的1.10倍和1.60倍。与对照(CK)相比，草甘膦处理显著抑制了柑桔树幼苗的生长，使株高和根系(主根)的长度较对照分别降低了11.18%和35.22%，使柑桔树幼苗茎叶和根系(主根)的干质量分别降低了53.57%和42.49%。在草甘膦胁迫条件下添加蚯蚓粪(Gly + EWC)，使柑桔树幼苗株高和根系(主根)的长度和干质量均较草甘膦处理(Gly)明显增加，其中株高及其干质量分别增加了26.23%和140.11%，是对照的1.12和1.11倍；根系(主根)长度和干质量分别增长了58.66%和96.73%，是对照的1.03和1.13倍，均达到显著性差异(p<0.05)(见图1)。可见，施用蚯蚓粪既能显著促进柑桔幼苗生长，也能帮助柑桔幼苗应对草甘膦胁迫，完全克服其不利影响。这可能与蚯蚓粪中富含植物生长所需的养分(如腐殖质、N、P和K)以及有利于植物生长的微生物群落有关[10，19，20]。

2.3 柑桔幼苗对草甘膦胁迫的生理反应

光合作用是植物生长发育的基础。叶绿素是光合作用器官的重要组成部分，具有双重功能，它捕捉光线，同时作为分离和传输电子的介质，为随后的光合产物的合成奠定了基础[21]。因此，叶绿素含量可以直观地反映植物光合作用是否受到外界影响。在本试验条件下，柑桔树幼苗培养42 d后的结果显示，4种处理柑桔幼苗叶片总叶绿素含量按照由大到小排列如下：EWC>Gly+EWC>CK>Gly。与CK相比，Gly处理总叶绿素含量下降了16.63%；Gly+EWC处理的总叶绿素含量是Gly处理的1.25倍，是CK的1.04倍(见图2)。这说明，施用蚯蚓粪能够促进柑桔幼苗的茁壮成长，在面对草甘膦胁迫时，总叶绿素含量不降反升。

注：不同字母表示相同部位不同处理之间差异显著(p<0.05)。

丙二醛(MDA)是膜脂过氧化作用的最终分解产物，它的产生还能加剧膜的损伤。在植物衰老生理和抗性生理研究中，丙二醛含量是一个常用指标，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度，也可间接反映植物组织的抗氧化能力的强弱[22]。本研究采用硫代巴比妥酸反应物(TBARS)法表征MDA水平，结果如图2B所示。EWC处理柑桔幼苗的叶片和根系中的TBARS水平分别比CK显著降低，说明施用蚯蚓粪有利于农作物植株保持旺盛的新陈代谢，降低柑桔树幼苗植株的MDA水平，延缓其衰老，这可能是由于蚯蚓粪有机肥具有供应养分和改良土壤的双重作用。单独用草甘膦处理(Gly)使柑桔幼苗叶片和根系中TBARS含量较CK显著增加，分别是CK的1.19倍和1.84倍，在蚯蚓粪参与下(Gly+EWC)，抑制了的TBARS含量的升高，叶和根中降幅分别达到12.09%和28.68%。这表明，施用蚯蚓粪能增强柑桔幼苗抗逆能力，缓解草甘膦毒害。

图2 蚯蚓粪作用下草甘膦对柑桔树幼苗总叶绿素(A)和TBARS(B)含量的影响

在植物中，非生物胁迫(如农药等环境污染物)所导致植物体中活性氧的爆发和大量蓄积，除了会造成细胞膜脂过氧化加剧，细胞膜损伤和程序性凋亡，还会作为信号激活植物体内的防御系统来应对外界胁迫。由多种抗氧化酶组成的抗氧化酶系统是其中重要的途径，它通过多种抗氧化酶的协同作用清除大量产生的以超氧阴离子(O2·-)和过氧化氢(H2O2)为代表的活性氧[23]。超氧化物歧化酶(SOD)被认为是植物抗氧化防御系统的第一道防线，它通过催化O2·-发生歧化反应生成H2O2和O2，清除细胞中多余的O2·-[24]。对于H2O2，植物细胞器中存在一系列H2O2处理酶，通过调节H2O2水平来保护植物免受氧化应激引起的细胞损伤[25]。其中，CAT在H2O2的清除效率上具有明显优势，它大量存在于植物过氧化物酶体中，发挥着快速去除H2O2中的主导作用[26]。大量研究表明，CAT活力的变化对于处于逆境(如环境污染等)中的植物所承受的氧化胁迫水平具有指示作用[27,28]。POD也能够清除过氧化氢，是另一种常用来指示植物中氧化应激程度的关键酶[28]。植物GST通过催化谷胱甘肽对各种亲电反应底物的亲核进攻，参与植物对各种生物或非生物胁迫的抵抗，包括外源性有毒物质的解毒和植物组织中内源性有毒代谢产物(如H2O2)的去除[10,28]。从图3中可以看出，不同处理柑桔幼苗组织的多种抗氧化酶(SOD、POD、CAT、GST)活力从大到小排序均为：Gly>Gly+EWC>EWC>CK(p<0.05)。可见，在没有草甘膦胁迫条件下施用蚯蚓粪，可以提高柑桔幼苗的抗氧化酶系统活力，从而使柑桔幼苗具备更强的抗氧化应激能力，抗逆能力增强；在草甘膦胁迫条件下施用蚯蚓粪，可以使草甘膦诱导升高的酶活性明显降低，氧化应激得到缓解，与TBARS含量的变化趋势一致，即施用蚯蚓粪可减轻草甘膦带来的氧化胁迫伤害，从而削弱对抗氧化酶系统功能的需求[10]。植物体中的POD除了清除H2O2，还能引发色素变性和脂质过氧化[29]。在Gly处理下，总叶绿素含量下调和TBARS含量上调可能与POD活性过高有关。

图3 蚯蚓粪作用下草甘膦对柑桔树幼苗组织超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽巯基转移酶(GST)活性的影响

3 结论

施用蚯蚓粪，虽然能增强土壤中草甘膦的生物可利用性，使其生物富集系数增大，从而更易于向农作物植株传输富集，但是在蚯蚓粪的参与下土壤中草甘膦残留大幅减少，柑桔幼苗蓄积的草甘膦不增反降，因此，总体上减轻了草甘膦胁迫压力。施用蚯蚓粪，能提高柑桔幼苗叶绿素含量、抗氧化酶系统活力和抗逆能力，维持旺盛的新陈代谢，促进柑桔幼苗生长，能够克服一定程度草甘膦胁迫造成的不利影响。以上发现对于草甘膦污染土壤的修复和高效利用具有参考意义。