大庆市某牧场牛白血病病毒感染情况调查

何思锐，武 瑞，连 帅，王建发，张 迪，高 丽

（1. 黑龙江八一农垦大学动物科技学院， 黑龙江 大庆 163319；2. 黑龙江省牛病防制重点实验室， 黑龙江 大庆163319）

牛白血病病毒（bovine leukemia virus，BLV）属于逆转录病毒， 主要引起牛地方流行性白血病（enzootic bovine leukosis，EBL）。 该病的特征主要包括持续性B 淋巴细胞增多及全身淋巴结肿大，潜伏期（一般为4～5 年）临床症状不明显，临床发病后死亡率较高。 BLV 可将自身RNA 转变为DNA，并整合至宿主基因组中以前病毒形式存在，且大多数BLV 感染牛因无明显临床症状被忽略。BLV 感染造成的奶牛泌乳量下降、淘汰率增加、免疫功能受损、患病风险升高及进出口限制等问题，制约着奶牛养殖业的健康可持续发展。 有调查显示，子宫内传播是垂直传播的重要途径，病毒载量（proviral load levels，PVL） 越高，BLV 传播的风险越高［1］。 目前，牛白血病的常规检测方法是采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清BLV 抗体，但检测成本较高且易出现假阴性和假阳性结果的问题［2-3］，因 此，将 荧 光 定 量PCR 检 测BLV 前 病 毒DNA 作为牛感染BLV 的辅助检测方法。

近年来，诸如芬兰［4］、瑞士［5］、丹麦［6］、荷 兰［6］等西欧发达国家已相继在全国范围内消灭了该病毒。 但在世界上其他地区，BLV 的感染和传播仍然非常普遍，诸如阿根廷、哥伦比亚、日本、韩国和中国台湾地区奶牛BLV 感染阳性率均超过40%［7-11］。 杨奕［12］2018 年调查研究发现，我国大陆地区奶牛BLV 阳性感染率为49.1%。 2014 年师庆伟等［13］通过ELISA 方法检测黑龙江省规模化奶牛场BLV 感染率为9.76%。 Yu 等［14］2019 年调查了黑龙江地区的9 个养殖场的BLV 感染情况，感染率在0～31.00%，大庆地区感染率为10.00%。但随着国内规模化牧场的快速发展和管理水平的提高，BLV 感染情况可能有所改变。 定期检测、早期预防BLV 感染对规模化牧场防控、净化该病具有重要意义，因此，该试验采用ELISA 和荧光定量PCR 法对大庆某规模化牧场进行了BLV 感染情况调查。

1 材料

1.1 试验样品

随机选取大庆市某规模化牧场泌乳期奶牛107 头，于尾根静脉采集5 mL 血液至含EDTA 真空采血管中， 一式两份并做好标记，2～8 ℃保存带回实验室。

1.2 主要试剂

BLV 阳性质粒， 由哈尔滨兽医研究所惠赠；BLV 抗体ELISA 检测试剂盒 （P02110-5）， 购自IDEXX 公司；天根DNA 提取试剂盒（DP304-03），购自天根生化（北京）科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（2×），购自宝日医生物技术（北京）有限公司；红细胞裂解液购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 主要仪器

荧光定量PCR 仪（CFX96） 产自美国伯乐公司； 核酸蛋白质测定仪产自美国热电公司； 移液器、离心机均产自德国Eppendorf 公司。

2 方法

2.1 ELISA 检测BLV 抗体

①试剂准备：用稀释缓冲液N.2 对阴、阳性对照品和样品进行20 倍稀释；用去离子水对浓缩洗涤液N.2 进行10 倍稀释；用稀释缓冲液N.1 对浓缩酶标抗体进行100 倍稀释。

②阴性对照孔：任取两孔加入100 μL 稀释好的阴性对照品；阳性对照孔：任取两孔加入100 μL稀释好的阳性对照品；样品孔：加入100 μL 待检样品。旋涡振荡器振荡，充分混匀，盖上盖板，置于37 ℃恒温培养箱中孵育1 h。

③取出孔板，弃掉孔中液体，每孔加入300 μL洗涤液，洗涤3 次，在最后一次弃掉液体后，甩净拍干。

④每孔加入100 μL 稀释的酶标抗体，盖上盖板，置于37 ℃恒温培养箱中孵育30 min。

⑤重复步骤③。

⑥每孔加入100 μL TMB 底物溶液N.13，室温条件下，避光孵育20 min，每孔加入100 μL 终止溶液N.3。 利用酶标仪检测样品和对照品在450 nm 下的吸光值。

2.2 荧光定量PCR 检测

2.2.1 引物设计参考文献中BLV pol 基因特异性引物序列［15］设计引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成， 上游引物序列：5′-CCTCAATTCCCTTTAAACTA-3′； 下游引物序列：5′-GTACCGGGAAGACTGGATTA-3′； 扩增片段长度为120 bp。

2.2.2 DNA 的提取吸取300 μL 全血样本置于1.5 mL 离心管中， 加入900 μL 的红细胞裂解液，颠倒混匀， 室温放置5 min，10 000 r/min 离心1 min，吸取上清液，留下白细胞沉淀；加入200 μL 缓冲液GA，振荡至彻底混匀；加入20 μL Proteinase K溶液，混匀；加入200 μL 缓冲溶液GB，混匀，70 ℃水浴10 min 至清亮，去除内壁水珠；加入200 μL无水乙醇，混匀15 s 后，将所得溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB3，12 000 r/min 离心30 s； 倒掉废液， 向吸附柱CB3 中加入500 μL 缓冲液GD，12 000 r/min 离心30 s；倒掉废液，将CB3 放入收集管， 向吸附柱CB3 中加入600 μL 漂洗液PW，12 000 r/min 离心30 s， 倒掉废液， 将吸附柱CB3放入收集管；重复上一步骤；12 000 r/min 离心2 min，倒掉废液，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；将吸附柱CB3 转入一个干净的无RNA 酶离心管， 向吸附柱中间部位悬空滴加50 μL 洗脱缓冲液TE， 室温5 min 后扯掉吸附柱CB3 的盖子，将离心管管盖扣在吸附柱CB3 上，12 000 r/min 离心2 min，将溶液收集到离心管中。

2.2.3 质粒标准品的制备用核酸蛋白质测定仪测定BLV 阳性质粒浓度， 根据拷贝数计算公式［ 拷 贝/μL =（6.02 ×1023） ×（ng/μL ×10-9）/（DNA Length×660）］计算拷贝数为4.17×1010拷贝/μL。并进行10 倍倍比稀释（102～108），作为荧光定量PCR的标准品。 反应程序：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 个循环进行扩增。

2.2.4 样品检测以提取的样品DNA 为模板进行扩增， 总体系为25 μL。 反应体系：ddH2O 9.5 μL， 上、 下游引物各0.5 μL （10 μmol/L），SYBR Premix Ex Taq（Tli RnaseH Plus）（2×）12.5 μL，DNA模板2 μL，按上述荧光定量PCR 反应条件进行检测，并与ELISA 检测结果进行比较。

3 结果

3.1 ELISA 与荧光定量PCR 检测结果

将107 份牛血清样品进行ELISA 检测， 共检出阳性样品34 份，ELISA 检测阳性率为31.78%；利用上述荧光定量PCR 检测方法加以验证，对107 份DNA 样本进行检测，结果显示，阳性样本数为40 份，阳性率为37.38%；两种检验方法的阳性重合率为85.00%（见表1）。

表1 ELISA 检测与荧光定量PCR 检测结果

3.2 荧光定量PCR 标准曲线的绘制

以665 ng/μL 的BLV 标准品为模板， 以起始模板浓度的对数为横轴、Ct 值为纵轴绘制标准曲线， 曲线方程为y＝-3.478x＋36.157， 相关性系数R2＝0.999 8。 在102～108拷贝/μL 范围内具有良好的线性关系（见图1）。

图1 荧光定量PCR 标准曲线

3.3 荧光定量PCR 检测结果

根据荧光定量PCR 检测结果中的阳性牛Cq值计算前病毒DNA 拷贝数，按照“高载量病毒＞1 000 拷贝数/ng＞低载量病毒”标准分出高、低病毒载量牛，高载量牛28 头，占牛总数的26.17%，低载量牛12 头，占阳性牛总数的11.21%，结果见表2。

表2 荧光定量PCR 检测结果

4 讨论

为了解大庆市某规模化牧场牛白血病病毒感染情况， 对采集的107 份样品进行了ELISA 检测与荧光定量PCR 检测，结果显示，ELISA 与荧光定量PCR 检出率基本一致， 分别为31.78%和37.38%， 表明该牧场牛群中存在一定程度的BLV感染。 目前，OIE 规定的国际动物贸易牛白血病检疫指定试验为ELISA 试验［16］，ELISA 试验操作简单便捷、敏感、快速，但对于处在感染早期的动物，检测灵敏度较低， 特异性抗体的检出通常需要1个月以上［17-18］，围产期母牛可将BLV 母源抗体通过初乳转移给新生犊牛［19］，用血清学方法检测早期和处于围产期的BLV 感染牛易产生假阴性结果。 已知外源性BLV 感染牛后主要侵害B 淋巴细胞，以前病毒DNA 形式终生存在于宿主细胞染色体中［20-21］，检测外周血淋巴细胞（PBMC）中的BLV前病毒DNA 可作为牛感染BLV 的证据。 该试验除采用ELISA 检测外，又使用荧光定量PCR 法进行了辅助确认。 一些国家也通过ELISA 试验结合荧光定量PCR 检测的措施筛查BLV 感染牛［22］。

该牧场存在一定程度的BLV 感染，可能与牧场动物之间频繁接触有直接关系， 这会导致病毒在牛群中水平传播。美国一项报告显示，有65%的BLV 感染牛呈高病毒载量， 而且高病毒载量的牛传染性高于低病毒载量牛［23］。 由于病毒载量是EBL 进展的一个重要危险因素，将感染BLV 的奶牛进行高、低病毒载量筛选，对防止病毒传播有重要意义。 该次试验中，除检测BLV 感染率外，通过计算发现，BLV 阳性牛中70%（28/40）是高病毒载量牛，30%（12/40）是低病毒载量牛，这一结果与此前日本的一项报道结果相似［24］。 澳大利亚某牧场曾将BLV 感染牛，尤其是BLV 高病毒载量牛单独饲养， 远离健康牛群从而使牧场BLV 感染率从63.8%下降到13.9%［25］。 由此可知，有效的BLV 监测、BLV 阳性牛的隔离以及良好的管理是将BLV传播风险降至最低的关键。 BLV 对畜牧行业的影响还处在研究阶段， 基于EBL 亚临床性流行的特点，EBL 的流行性调查对养殖业净化该病有着重大的意义。在今后的研究中，应扩大检测范围，明确东北地区乃至全国范围BLV 感染情况。

5 结论

通过ELISA 方法对大庆市某牧场107 头奶牛白血病病毒感染情况进行调查， 并用荧光定量PCR 法加以验证。ELISA 检测结果显示：BLV 感染阳性率为31.78%（34/107）；荧光定量PCR 结果显示：BLV 感染阳性率为37.38%（40/107）。 此外，通过计算发现，BLV 高载量牛占总数的26.17%（28/107），低载量牛占总数的11.21%（12/107），说明该牛群中的BLV 可能存在较高传染性。