河南省鸡源结肠弯曲杆菌的分离鉴定及耐药性分析

于 辉，李金磊，方忠意，巩 丹

（1.河南省动物卫生监督所，河南 郑州 450008；2.河南省兽药饲料监察所，河南 郑州 450008）

耐热弯曲杆菌属， 特别是空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌， 是常引起人畜共患细菌感染病的病原体［1］。 食用未煮熟的肉制品、受污染的水、未经巴氏消毒的乳制品以及与带菌动物密切接触等均可导致感染［2］。 弯曲杆菌病是一种自限性疾病，在大多数情况下不需抗生素治疗， 免疫功能低下的病例、严重或长期感染的病例，则须使用抗生素进行治疗［3］。

在一些国家， 弯曲杆菌是导致急性细菌性胃肠炎的主要细菌之一， 每年因弯曲杆菌引起的胃肠炎多达4 亿～5 亿例［3-4］。弯曲杆菌普遍存在于家禽肠道中，从家禽粪便、泄殖腔拭子和盲肠内容物均可分离出［5-6］，因此，加强对鸡源弯曲杆菌的监测对维护公共安全具有重要意义。

该文通过对河南省鸡源结肠弯曲杆菌的分离鉴定及药物敏感性试验， 掌握河南省鸡源结肠弯曲杆菌分布及药物敏感性情况， 为兽医临床用药和结肠弯曲杆菌感染的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源鸡泄殖腔拭子460 份， 采自河南省郑州市、鹤壁市、新乡市、焦作市、许昌市、漯河市、 商丘市7 个地区的规模化蛋鸡养殖场的260～390 日龄健康鸡。

1.1.2 菌株结肠弯曲杆菌标准菌株（CICC 23925）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.3 培养基与试剂Preston 肉汤、 脱纤维绵羊血、CCDA 培养基、哥伦比亚血琼脂培养基购自北京陆桥技术股份有限公司；96 孔药敏板、 无菌马血清购自上海星佰生物技术有限公司； 一次性无菌滤膜（0.45 μm）购自广州环凯微生物科技有限公司；琼脂糖购自Biowest 公司；DNA Marker DL 2 000、PCR 预混酶购自北京康为世纪生物科技有限公司；50×TAE 购自北京索莱宝科技有限公司；α-氰-4-羟基肉桂酸购自Sigma 公司。

1.1.4 仪器设备生物安全柜（AC2-6S1 型，新加坡ESCO 公司），恒温培养箱（IPP110 型，德国美墨尔特公司），离心机（3-18K 型，德国Sigma 公司），PCR 仪（LabCycler Standard Plus 型，德 国SENSO公司），电泳仪（EPS301 型，美国GE 公司），凝胶成像分析系统（GeiDoc XR 型，美国Bio-Rad 公司），高压灭菌锅（HVE-50 型，日本Hirayama 公司），基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 （Axima-Performance 型，日本岛津公司），厌氧罐［日本三菱瓦斯化学商贸（上海）有限公司］，移液器（德国艾本德公司）等。

1.1.5 引物根据结肠弯曲杆菌基因序列的保守片段，设计引物，上游P1：5′-AGG CAA GGG AGC CTT TAA TC-3′， 下游P2：5′-TAT CCC TAT CTA CAA ATT CGCTAT CCC TAT CTA CAA ATT CGC-3′，扩增片段长度为364 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 样品采集及预增菌用无菌棉签采集鸡泄殖腔拭子，立即转接到含5%脱纤维绵羊血的Preston 肉汤中、微需氧条件下运送至实验室，42 ℃培养4～6 h。

1.2.2 分离纯化吸取50 μL 预增菌培养液滴加到铺有无菌滤膜的CCDA 培养基上， 均匀滴加到5～6 个点，每个点约10 μL，室温静置5～10 min，待液体透过后去掉滤膜， 将培养基放入42 ℃恒温箱，微需氧培养24～48 h，挑取单个疑似菌落划线接种于哥伦比亚血琼脂平板，42 ℃培养24 h。

1.2.3 PCR 鉴定用灭菌棉签挑取纯化好的菌落， 加入装有无菌生理盐水的1.5 mL 离心管，反复冷冻、 煮沸2～3 次，12 000 r/min 离心取上清液作为PCR 扩增模板。 同时设阳性对照（模板为结肠弯曲杆菌标准菌株核酸）、阴性对照（模板为无菌生理盐水）和空白对照（模板为ddH2O）。

反应体系：Taq PCR Master Mix 25 μL，ddH2O 18 μL，P1、P2 各1 μL，模板5 μL。

PCR 反 应条 件：5 min， 94 ℃；1 min，94 ℃，1 min，64 ℃，1 min，72 ℃，2 个 循 环；1 min，94 ℃，1 min，62 ℃，1 min，72 ℃，2 个 循 环；1 min，94 ℃，1 min，60 ℃，1 min，72 ℃，2 个 循 环；1 min，94 ℃，1 min，58 ℃，1 min，72 ℃，2 个 循 环；1 min，94 ℃，1 min，56 ℃，1 min，72 ℃，2 个 循 环；1 min，94 ℃，1 min，54 ℃，1 min，72 ℃，30 个循环；10 min，72 ℃。

配制浓度为1.5%的琼脂糖溶液，于微波炉中加热溶解，待冷却至50～60 ℃时，加入溴化乙锭（使终浓度达到0.5 μg/mL）混匀，倒入已插上梳子的胶槽。 待凝固后，转入电泳槽，在每个泳道中加入8 μL 的PCR 产物，160 V 电泳20～30 min。 电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪上成像。

1.2.4 基质辅助激光解吸电离（MALDI-TOF MS）飞行时间质谱鉴定

1.2.4.1 样品制备向1.5 mL 离心管中加入1 mL 75%的无水乙醇，从哥伦比亚血琼脂平板上挑取4～6 个菌落于离心管中，振荡混匀，超声3 min，12 000 r/min 高速离心2 min， 弃去上清液。 加入50 μL 70%甲酸、50 μL 乙腈， 振荡混匀， 超声3 min，12 000 r/min 高速离心2 min，收集上清液。

1.2.4.2 点样用移液器取1 μL 上清液， 点涂于MALDI 靶板孔上，自然晾干；再取2 μL CHCA 基质（50%CAN，50%H2O，1%TFA）覆盖到样品上，自然晾干，将靶板放入质谱仪进行测量。

1.2.4.3 质谱分析质谱仪器参数调整如下：峰值调整模式为线性，阳离子模式，分子质量范围2 000～20 000 Da； 每孔采样100 次； 激光强度50 Hz；离子源加速电压20 kV。 每次试验前都要进行仪器校准：选择标品靶孔，采集一级质谱图。

利用Shimadzu Biotech Launchpad 软件对采集的数据图谱进行分析鉴定。 采集结果导入Mascot数据库，与标准图谱比对，经过软件计算给出得分和鉴定结果，得分70 分（含）以上表示结果可信，70 分以下表示结果可疑。

1.2.5 药敏试验采用微量肉汤稀释法， 监测结肠弯曲杆菌对阿奇霉素、环丙沙星、红霉素、庆大霉素、四环素、氟苯尼考、萘啶酸、泰利霉素、克林霉素9 种抗菌药的耐药性。

取哥伦比亚血琼脂平板上经鉴定的结肠弯曲杆菌菌落数个， 用生理盐水调制0.5 MCF， 吸取60 μL 加入12 mL 药敏培养液（含600 μL 无菌马血清）， 然后分别取100 μL 加入96 孔药敏板，将药敏板放入厌氧罐，同时放入微需氧产气袋，42 ℃培养20～24 h，读取药敏试验结果，按照CLSI 判定标准进行药敏结果判定， 各抗菌药物的判定标准见表1。

表1 结肠弯曲杆菌抗菌药物折点

2 结果与分析

2.1 样品中结肠弯曲杆菌分离鉴定结果

通过对样品的选择性分离纯化， 经PCR 和MALDI-TOF MS 飞行时间质谱鉴定，460 批样品共分离结肠弯曲杆菌42 株，分离率为9.13%。PCR和MALDI-TOF MS 飞行时间质谱鉴定结果见图1和表2。

图1 结肠弯曲杆菌部分样品PCR 鉴定结果

表2 结肠弯曲杆菌PCR 和MALDI-TOF MS 飞行时间质谱鉴定结果

2.2 药敏试验结果

分离的42 株结肠弯曲杆菌对环丙沙星、萘啶酸、 阿奇霉素耐药比较严重， 耐药率分别为95.24%、90.48%、71.43%， 对氟苯尼考比较敏感，耐药率为0，具体结果见表3。

表3 河南省鸡源结肠弯曲杆菌对9 种抗菌药物的药敏结果 单位：%

多重耐药方面，分离的42 株结肠弯曲杆菌有34 株（80.95%）耐3 种及3 种以上药物，4 重耐药最多，有16 株（38.10%），具体结果见表4。

表4 河南省鸡源结肠弯曲杆菌多重耐药结果（药物大类）

3 讨论

从20 世纪90 年代以来， 弯曲杆菌对大环内酯类和氟喹诺酮类药物的耐药性不断增加， 动物源性食品可通过食物链将耐药弯曲杆菌传递给人类［7-8］。 家禽，主要是鸡，被认为是弯曲杆菌的重要储存者［9］。 我国是家禽饲养和消费大国，加强鸡源结肠弯曲杆菌的监测对促进家禽业健康发展维护人类安全具有重要意义。

试验从河南省养鸡场采集泄殖腔拭子， 通过选择性增菌、分离，最后通过PCR 和MALDI-TOF MS 飞行时间质谱对分离菌株进行鉴定，提高了结肠弯曲杆菌分离的准确性。 结肠弯曲杆菌的分离率为9.13%（42/460），这一结果比邓义贞等［10］从鸡泄殖腔拭子样品中的分离率分别为14.67%（44/300）低，与张小燕等［11］从泄殖腔棉拭子样品中的分离率为11.32%（60/530）和唐梦君等［12］从规模化养鸡场、 农贸市场和超市的鸡泄殖腔样品以及鸡肉产品中的分离率为10.80%（81/750）相当。 这些差异可能与不同地区养殖企业的养殖环境和饲养管理水平有关。

该研究分离的河南省鸡源结肠弯曲杆菌对环丙沙星、萘啶酸、阿奇霉素耐药严重，耐药率均在70%以上，对四环素、泰利霉素、克林霉素、红霉素耐药较为严重，耐药率50%～70%。 这一结果与国内报道的鸡源结肠弯曲杆菌对环丙沙星、萘啶酸、四环素、克林霉素的耐药率较高一致［11-14］，河南省鸡源结肠弯曲杆菌对庆大霉素的耐药率较聂荷敏等［15］报道的69.70%、张小燕等［11］报道的71.25%和唐梦君等［12］报道的71.00%低。 该研究中河南省鸡源结肠弯曲杆菌对环丙沙星、萘啶酸、四环素的耐药率较高， 这与家禽腹泻等疾病的治疗过程中大量使用喹诺酮类和四环素类药物密切相关； 研究结果与其他报道有所差异， 可能与不同地区家禽饲养环境、 饲养水平以及家禽治疗中使用和饲料中添加抗菌药物的种类相关。 近两年受非洲猪瘟的影响， 人们对于鸡肉产品的消费需求增加，因此，要在家禽饲养环节有效控制弯曲杆菌，加强生产管理，控制禽肉生产链中抗菌药物的使用，促进动物性食品的安全，保障人类健康。

4 结论

该研究从河南省蛋鸡养殖场采集460 份样品，共分离42 株结肠弯曲杆菌，总体分离率为9.13%，通过对分离菌株进行药物敏感性试验发现， 分离菌株对环丙沙星、 萘啶酸、 阿奇霉素耐药率均在70%以上，有34 株（80.95%）耐3 种及3 种以上药物， 表明河南省鸡源结肠弯曲杆菌耐药率较为严重，应加强家禽结肠弯曲杆菌耐药性的监测。