隶属度法优化黑顺片炮制工艺研究

王 涵， 高盼盼， 李 天， 许璐璐， 张辰露

(陕西理工大学 生物科学与工程学院， 陕西 汉中 723000)

附子为毛茛科植物乌头(AconitumcarmichaeliiDebx.)子根的加工品，是典型的毒性中药，具有回阳救逆、散寒止痛的功效[1]。临床使用前必须经过特定工艺炮制，将毒性较强的双酯型生物碱DDAs水解生成毒性较低的单酯型生物碱MDAs[2]，目前临床使用的附子饮片多以黑顺片为主。汉中是国内附子的主产区之一，其种植历史已有300余年，且种植规模居全国前列，但附子炮制加工依然存在诸多问题[3]，例如随意变更蒸煮时间使附子饮片加工不足或过度，导致药效成分含量过高或过低；重胆浸泡，导致饮片灰分超标等，严重影响了汉中附子饮片的整体品质[4]。历版《中华人民共和国药典》收录了黑顺片炮制过程为“取泥附子按大小洗净浸入胆巴的水溶液数日，连同浸液煮至透心，捞出，切片，水漂，蒸至油面，烘干”。2020年版《中华人民共和国药典》[1]中虽然增加了灰分检测指标，但对浸胆时间、蒸煮时间、漂水时间等具体工艺步骤仍未明确操作规范[5]。因此，本文采用正交试验与隶属度法评价对黑顺片炮制工艺进行优化，为附子饮片产地加工实践提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材

附子药材由陕西华克生物医药有限公司提供，经陕西理工大学生物科学与工程学院周天华博士鉴定为毛茛科乌头属植物乌头的子根。将新鲜的泥附子去掉须根，清洗干净，从中取1份趁鲜切0.5 cm片，干燥制成生附片，作为对照组。

1.1.2 主要试剂

苯甲酰新乌头原碱BMA(批号：19032406，纯度≥99.73%)，苯甲酰乌头原碱BAC(批号：18110710，纯度≥98.99%)，苯甲酰次乌头原碱BHA(批号：19032807，纯度≥99.66%)，新乌头碱MA(批号：18111001，纯度≥98.12%)，乌头碱AC(批号：18110905，纯度≥98.01%)，次乌头碱HA(批号：18111308，纯度≥99.04%)，以上对照品均购于北京仪化通标科技有限公司。超纯水(仪器)，乙腈、甲醇、二乙胺为HPLC级，盐酸、氨水为分析级，胆巴。

1.1.3 仪器与设备

Thermo Fisber Ultimate 3000高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)，ME104E/02电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，SHZ-95B循环水式多用真空泵(河南巩义市英峪予华仪器厂)，德国IKA旋转蒸发器(巩义市予华仪器有限公司)，Q-300DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，DHG-9145电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，UPH-11-20T超纯水机(四川优普超纯科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 黑顺片的炮制

附子2019年7月购于陕西汉中南郑区胡家营附子生产基地，在2015版《中华人民共和国药典》[6]中黑顺片加工基本流程基础上进行工艺优化。按照泥附子个头大小，挑选出同一等级的新鲜泥附子作为试验材料，去除残茎及毛根，清洗，浸泡于3 mol/L胆巴液中数日，之后按照煮制、切片、漂片、蒸制、烘干的基本流程处理。

1.2.2 酯型生物碱的含量测定

1.2.2.1 供试样品溶液的制备

精密称取生附子及黑顺片炮制品粉末(过三号筛)2.00 g，平行称取3份，置具塞锥形瓶中，加氨试液(体积分数40%氨水)2 mL，精密加入乙醚50 mL，称定质量，超声30 min，用乙醚补足挥发的重量，过滤。精密量取滤液25 mL，40 ℃以下减压回收溶剂至干，加入体积分数0.05%盐酸甲醇混合溶液3 mL溶解，待残渣完全溶解后用0.22 μm滤膜过滤，取滤液，即为供试品溶液，备用[7]。

1.2.2.2 对照品溶液的制备

取BMA、BAC、BHA、MA、AC、HA对照品，精密称量，加入体积分数0.05%盐酸-甲醇混合溶液制成混合对照品母液。其中BMA浓度为1.08 mg/mL、BAC浓度为1.06 mg/mL、BHA浓度为0.80 mg/mL、MA浓度为1.07 mg/mL、AC浓度为1.06 mg/mL、HA浓度为0.98 mg/mL。分别吸取0.5、0.2、0.2、0.5、0.2、0.5 mL定容至10 mL制成混合对照品溶液①，再精密吸取混合对照品溶液①1 mL，加体积分数0.05%盐酸-甲醇溶液稀释至10 mL，摇匀，即得混合对照品溶液②。混合对照品溶液①和混合对照品溶液②分别上样检测，设置梯度进样量。

1.2.2.3 色谱条件

色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18(4.6×250 mm，5 μm)；以乙腈为流动相A，以体积分数3 ‰二乙胺为流动相B，进行梯度洗脱(0～30 min，体积分数25%～45% A；30～40 min，体积分数45%～55% A；40～50 min，体积分数55%～65%A；50～60 min，体积分数65%～75% A)；检测波长240 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL，流速1.0 mL/min。在该色谱条件下，理论塔板数应不低于5000，分离度>1.5。

1.2.2.4 样品测定

取已知浓度的混合对照品溶液、供试品溶液，按照1.2.2.3项下色谱分析条件测定生附子及黑顺片炮制品中6种主要生物碱BMA、BAC、BHA、MA、AC、HA的含量。采用标准曲线法计算样品中这6种酯型生物碱含量。

1.2.3 线性关系考察

精密吸取1.2.2.2项下的混合对照品溶液①各3、5、10、15、20 μL和混合对照品溶液②各2、3、5、10、15 μL，注入液相色谱仪中，测定峰面积。以6种生物碱对照品的峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程及其线性范围，结果见表1。

表1 6种酯型生物碱线性范围及线性关系

1.2.4 附子炮制工艺正交试验

在黑顺片传统炮制工艺(洗净、浸胆、煮透、水漂、切片、蒸透、烘透)的基础上，考察选取了4个关键工艺因素，设置3个水平，因素水平见表2。取相同大小等级的新鲜泥附子样品9份，每份约1 kg，设置3次平行，按照L9(43)正交表进行炮制处理，进行黑顺片炮制工艺优化研究。

表2 黑顺片炮制工艺正交试验因素水平

1.2.5 总灰分、酸不溶性灰分的测定

准确称取附子样品约4.00 g，参照文献[8]灰分测定法对试验样品的总灰分、酸不溶性灰分指标进行考察,每个样品设置3次平行。

2 结果与分析

2.1 附子中6种酯型生物碱对照品和样品的HPLC图

分别取生附子及黑顺片样品，按1.2.2.1项下分别处理，得到供试品溶液，并取1.2.2.2项下附子6种酯型生物碱对照品混合液，按照1.2.2.3项下色谱条件进行测定，结果如图1所示。

(b)生附子

(c)黑顺片1.BMA； 2.BAC； 3.BHA； 4.MA； 5.AC； 6.HA图1 附子生物碱对照品和供试品的HPLC图

2.2 正交试验结果分析

作为毒性药材，附子饮片的品质评价具有复杂性和不确定性的特点。本研究采用多维模糊综合评判方法(隶属度法)对黑顺片质量进行综合评价。隶属度法是针对受多种因素影响的事物做出全面评价的一种十分有效的多因素决策方法[9]。对于欲达到最大值的指标(如MDAs总含量和外观评分)，其指标隶属度=(指标值-指标最小值)/(指标最大值-指标最小值)；对于限量指标(如DDAs总含量)，其指标隶属度=(指标最大值-指标值)/(指标最大值-指标最小值)。指标最大值的隶属度为1，而限量指标的隶属度为0，所以0≤指标隶属度≤1[10]。为保障黑顺片的安全性和有效性，在提高单酯型生物碱总含量与降低双酯型生物碱总含量的同时，还要避免过度加工导致双酯型生物碱完全消失，同时饮片品质评价也需考虑饮片外观性状指标[11]。因此本研究以饮片传统外观性状、单酯型生物碱总含量及双酯型生物碱总含量为评价指标，评分时以各指标的最大值作为参照，对同一指标的数据进行标准化处理。权重比例为单酯型生物碱总含量占50%，双酯型生物碱总含量占35%，外观评分占15%，综合评分=单酯型生物碱总含量评分×50%+双酯型生物碱总含量评分×35%+炮制品外观评分×15%，满分为1.00[12]。正交试验设计及结果见表3，方差分析见表4。

黑顺片外观性状评分评价方法参照林华等的方法[10]，满分为10分。“黄褐色发亮”“质地实、酥脆断面光泽”“气微，无麻舌感”(10分)；“黄褐色”“质地实、较为酥脆断面较有光泽”“气微，微有麻舌感”(7分)；“皮部褐色、木质部为黄白色”“质较坚实、略呈粉性断面略有光泽”“气微，有麻舌感”(5分)；“黄白色”“质硬、呈粉性断面粗糙”“气微，麻舌感强烈”(1分)。

由表3和表4结果可知，影响黑顺片质量的因素主次顺序为A(浸胆时间)>D(蒸制时间)>C(漂片次数)>B(煮制时间)；其中浸胆时间、蒸制时间对综合评分的主效应有统计学意义(P<0.05)，24 h内漂片次数和煮制时间的作用影响程度未达显著。通过综合分析确定黑顺片炮制的最佳工艺为A1B1C3D2，即浸胆7 d、煮10 min、漂片(24 h内换3次水)、蒸制2.5 h。

表3 黑顺片炮制工艺的正交试验结果 n=3

表4 黑顺片炮制工艺方差分析结果

2.3 最佳工艺验证

为进一步验证试验结果的准确性和稳定性，再取大小同等级的新鲜泥附子各3份，每份1000 g，按上述A1B1C3D2最佳工艺进行炮制，并对其炮制过程分步采样，检测其6种生物碱含量。结果见图2。

不同英文字母表示含量存在显著性差异，P<0.05图2 黑顺片炮制过程中不同酯型生物碱含量

由图2可知：3种双酯型生物碱总含量以生附子(对照组)为最高，并在炮制过程中逐步降低；3种单酯型生物碱总含量以黑顺片为最高。泥附子浸胆7 d后双酯型生物碱总含量降低至对照组的0.91倍，而单酯型生物碱总含量降低至对照组的0.22倍。煮制过后，双酯型生物碱总含量降低至对照组的0.35倍，而单酯型生物碱总含量降低至对照组的0.13倍。漂片过程导致生物碱含量降低，且单酯型生物碱总含量达整个黑顺片炮制过程中最低值，降低至对照组的0.05倍，双酯型生物碱总含量降低至对照组的0.26倍。蒸制步骤可使双酯型生物碱总含量降低至上一步骤的0.15倍，单酯型生物碱总含量增加至上一步骤的21.32倍。按最优工艺炮制的黑顺片中3种双酯型生物碱总含量分别降低至对照组的0.04倍，而3种单酯型生物碱的总含量升高至对照组的1.23倍。验证结果与正交试验拟合结果基本一致，黑顺片的双酯型生物碱总含量范围为0.002 9%～0.014 6%，单酯型生物碱的总含量范围为0.030 4%～0.039 4%，均符合2020版《中华人民共和国药典》关于黑顺片的生物碱指标限定的要求。

2.4 总灰分、酸不溶性灰分测定

对正交试验及其炮制环节中总灰分、酸不溶性灰分测定结果，如表5所示。

表5 炮制样品的灰分测定结果 n=3

从表5可知：生附子中总灰分、酸不溶性灰分最低，胆附子的总灰分最高，说明浸胆会引起盐分的高残留，导致其总灰分、酸不溶性灰分值增大，而煮制、漂片工艺可以明显减少盐分残留，从而降低总灰分、酸不溶性灰分。2020版《中华人民共和国药典》关于附子灰分指标的限定为总灰分不超过6%、酸不溶性灰分不超过1%，而以本文中优化工艺加工的黑顺片的总灰分均低于5%，酸不溶性灰分均低于1%，符合最新版药典要求。

3 讨论

现代研究表明附子生品毒性大，所含酯型生物碱既为有效成分，又为毒性成分[13-14]，其中双酯型生物碱是附子的主要毒性成分，但同时也具有强心、抗炎镇痛等作用。双酯型生物碱理化性质不稳定，在湿热的条件下容易发生水解，一部分转化成单酯型生物碱，另一部分转化成出醇胺型生物碱或者经过酯交换转化成难溶于水的酯型生物碱[15]。炮制是附子减毒增效的重要传统措施，然而炮制过度，则令有效成分严重损失，直接影响药效。酯型生物碱类成分是药典规定的评价附子饮片质量是否合格的关键指标。本研究以“减毒增效”为目标，通过正交试验研究了浸胆时间、煮制时间、漂片次数及蒸制时间4个工艺参数对黑顺片炮制效果的影响，采用正交试验及隶属度法评价优化了黑顺片炮制工艺，最优工艺可实现黑顺片的3种单酯型生物碱总含量提高到生附片的1.42～1.83倍，3种双酯型生物碱总含量降低至生附片的0.01～0.05倍，灰分指标亦符合2020年版《中华人民共和国药典》要求，表明该工艺不仅降低了附子毒性，同时又保留了适量毒性成分兼药效成分的双酯类生物碱，并有效控制了胆盐残留。

目前关于黑顺片传统炮制工艺争议最大的问题就是胆巴的使用问题。浸胆是附子传统炮制工艺的最初处理工序，具有防腐作用，同时降低了生物碱含量，然而胆巴对胃有腐蚀性，若附子饮片胆盐残留超标不仅会影响饮片质量，还会引发附子的不良副作用[16-18]。杨千千等[19]提出使用20%浓度以上的胆巴浸泡泥附子，其质量相对稳定；周林等[16]指出泥附子经过浸胆9 d即可达到防腐的目的，且随着浸泡时间的增长，单酯型生物碱和双酯型生物碱含量会下降70%以上，这与本试验中关于浸胆时间的结果基本一致。适当的缩短浸胆时间，就可以达到防腐和减毒的效果。汪云伟[20]提出黑顺片“味”的变化与炮制中胆巴的引入有关，这也是影响黑顺片感官评价的重要依据。刘雨诗等[21]对比了有胆附片和无胆附片的生物碱成分，二者均可降低毒性成分，但有胆炮制存在炮制过度之嫌，认为无胆炮制工艺不引入无机杂质，具有推广和应用价值。

近年来随着技术发展，附子炮制出现一些现代炮制方法，如王昌利等[22]将生附片加两倍量水浸泡24 h至全部泡透后置于锅内蒸10 h，晾干即得。该法总酯型生物碱含量较高，酯型生物碱含量较低，操作较方便，但耗时较长。方莉等[23]将生附片经过润湿处理后，0.10 MPa压力下蒸制150 min，干燥即得。此法工艺简便、需要设备较简单、易操作、具有一定的生产指导意义，但该炮制工艺改动较大，仍需对其高温炮制的作用机制、毒理学和药理学展开研究；杨昌林等[24]进行了湿热蒸制和干热烘制的探究，其中湿热蒸制法将生附片加水浸透后，于120 ℃的温度下蒸制20 min，获得蒸附片，而干热烘制法将生附片于150 ℃于电热恒温鼓风干燥箱内烘40 min，即得烘附片。两种方法均能有效去除毒性成分，并保留有效成分，为附子炮制提供了新路径。这些新的炮制方法，均印证了蒸制这一环节在附子炮制中的关键作用。

2020年版《中华人民共和国药典》虽然新增了灰分检测指标，但在具体饮片炮制工艺步骤上仍未进行统一规范。药典收载的黑顺片炮制方法由清代流传至今，经受住了时间的检验。虽然现代炮制方法多样，但仍需要经过一系列的药理、临床测试。因此，遵循“守正创新”中医药发展指导原则在饮片传统炮制工艺的基础上进行工艺优化是相对适用的。