决明胰蛋白酶抑制剂的同源建模与定点突变

李超林，张 田，邹 萌，廖 海，周嘉裕

(西南交通大学 生命科学与工程学院，成都 610031)

Kunitz蛋白酶抑制剂(Kunitz protease inhibitor，KPI)是存在于植物中的一类活性肽，能够与胰蛋白酶等丝氨酸蛋白酶形成复合物，竞争性抑制靶酶的活性[1]。KPI在植物抵抗生物及非生物胁迫中发挥重要作用，具有抗虫、抗肿瘤、抗感染、抗病毒和抗真菌等多种生物学活性。牛蓓等[2]将麻疯树Kunitz型蛋白酶抑制剂基因转入烟草中，通过叶片饲养棉铃虫幼虫实验证明，转基因植株对棉铃虫具有一定的抗虫性；Fang等[3]从韩国大黑豆中纯化出Kunitz型胰蛋白酶抑制剂，能够抑制HIV-1反转录酶的活性，具有抑制HIV-1病毒增殖的潜能。

分析大豆胰蛋白酶抑制剂(Soybean trypsin inhibitor，STI)等KPI家族成员的三维结构晶体，发现它们具有典型的β-三叶草(β-trefoil)型三维结构。该类结构包含了一个由12个反向平行β-折叠组成的疏水核心，其中6个β-折叠形成底部的β-桶(β-Barrel)，其余6个β-折叠形成疏水核心顶部的盖子(Lid)。该疏水核心的稳定性对于整体结构的维系发挥关键性作用。根据序列比对分析，发现疏水核心中存在较多的芳香族与脂肪族等疏水性氨基酸，推测它们通过疏水作用和氢键与邻近的氨基酸相互联系，参与核心结构的形成与稳定。由此，确定这些疏水性氨基酸并认识其作用能够有助于认识β-三叶草结构形成的分子机制，并对未来的结构改造具有指导作用。

决明(Cassiaobtusifolia)为豆科决明属植物。实验室在前期研究中，从决明种子中克隆得到决明胰蛋白酶抑制剂(Cassiaobtusifoliatrypsin inhibitor，CoTI，GenBank登录号AIU39184.1)基因的全长cDNA序列，并获得有活性的重组蛋白[4]。分析CoTI氨基酸序列，发现CoTI与其他KPI成员均含有1个保守的Trp114残基，随后利用同源建模的方法预测CoTI的三维结构及Trp114残基在三维结构中可能的作用，最后通过定点突变对推测进行验证，为CoTI的结构研究及可能的分子改造奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

CoTI-pET28a重组大肠杆菌表达载体由本实验室构建并保存，大肠杆菌Rosseta(DE3)由本实验室保存；限制性内切酶、Prime star DNA聚合酶、T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司；BAPNA(N-Benzoyl-DL-arginine-p-nitroaniline)购自Sigma公司；质粒提取试剂盒Omega Plasmid Mini Kit I、胶回收试剂盒Gel Extraction Kit为OMEGA公司产品；定点突变系统Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2购自南京诺唯赞公司；异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)购自MEKER公司；卡那霉素、氯霉素购自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 序列比对及同源建模

从PDB数据库中选择同源建模的模板序列，其氨基酸序列与CoTI的一致性大于或等于30%，使用SWISS-MODEL对CoTI进行同源建模获得其三维结构。使用MEGA7.0进行多序列比对，使用PyMol对其模型进行可视化分析和处理。

1.2.2 模型验证

利用PROCHECK和Verify-3D程序对模型进行评估。Ramachandran plot用于阐述肽平面内两个二面角(φ与ψ)的比值，以表明氨基酸残基的允许和不允许的构象，通过PROCHECK 计算的 Psi/Phi Ramachandran图来评估模型的立体化学可靠性[5]。蛋白质侧链氨基酸残基的兼容性通过Verify-3D进行评价[6]，至少80%的氨基酸残基得分≥0.2则通过验证。

1.2.3CoTI基因的定点突变

定点突变采用ClonExpress公司生产的Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2，基于一步法[7]，利用CoTI-pET28重组载体为模板，根据W114所对应的核苷酸设计突变引物(表1)。

表1 突变引物及其序列

PCR反应体系总量为50 μL，在美国Applied Biosystems公司Veriti 96孔快速PCR 仪上进行。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性15 s，63 ℃退火15 s，30个循环；72 ℃延伸50 s；最后72 ℃再延伸300 s。突变质粒DNA的片段回收、酶切、克隆、转化方法均参照文献[8]和试剂盒说明。最后突变体菌株提取质粒、酶切和PCR鉴定，送往成都擎科梓熙生物技术有限公司测序，验证突变的正确性。

1.2.4 突变体的表达、纯化及活性检测

(1)参照文献[8]：突变体菌株在含卡那霉素和氯霉素的液体LB培养基中37 ℃、200 r/min培养到A600值为0.6～0.8时，加入IPTG使其终浓度为1 mmol/L，过夜诱导表达(27 ℃，180 r/min)。诱导菌液使用超声破碎仪(总时长为30 min，超声3 s/间隙3 s，功率45 W)进行破碎，经Ni2+亲和柱纯化后得到纯化突变体。(2)突变体的活性检测参照文献[9]：采用BAPNA(N-benzoyl-DL-arginine-p-nitroaniline)为胰蛋白酶底物，活性检测实验重复3次。(3)菜青虫中肠胰蛋白酶提取方法参考文献[9]:取4～5龄虫固定于滴有石蜡的托盘，托盘置于冰上，截取菜青虫中肠及其内含物，用液氮研磨成粉末，加入150 mmol/L NaCl溶液1 mL，制成匀浆，于冰浴中抽提蛋白10 min后，使用12 000 r/min，4 ℃离心15 min，取上清液即为中肠酶液，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定浓度，保存于-80 ℃备用。

1.2.5 突变体的荧光光谱检测

平衡CoTI和突变体蛋白液的终浓度为1.0 mmol/L，然后用日本日立公司F-7000光度计测定相应的吸光值。检测条件限定为：280 nm的激发波长，激发狭缝宽度为5 nm，发射狭缝宽度为10 nm，扫描速度为1 200 nm/min，在荧光分光光度计上记录CoTI和突变体蛋白在300～400 nm范围内的荧光发射光谱。

2 结果与分析

2.1 序列比对和同源建模

Blast结果显示：CoTI的氨基酸序列与大豆胰蛋白酶抑制剂STI(Soybean trypsin inhibitor，PDBid：1BA7)同源性最高，达到了35%的序列相似性(图1)。因此，选择STI作为同源建模的模板。二级结构预测结果表明：CoTI与大多数Kunitz类胰蛋白酶抑制剂一样，由12个β折叠组成(图1)。CoTI模型与STI的RMSD为1.33，Z Score为10.4，表明这两者具有相似的三维整体结构。

图1 CoTI同源建模结构

2.2 验证建模模型

使用PROCHECK和Verify-3D程序对CoTI模型进行评估。PROCHECK计算的Psi/Phi Ramachandran图结果表明CoTI模型的绝大多数φ、ψ二面角均处于合理范围内，其中允许区域占83.2%，最大允许区域占16.1%，不允许区域仅为0.7%，见图2(a)。Verify-3D 分析结果显示CoTI模型中有94.77%的侧链氨基酸残基得分在0.2以上，具体见图2(b)。

图2 拉氏图(a)和 CoTI模型的Verify 3D评价图(b)

2.3 CoTI蛋白模型分析

CoTI三维结构由12个反向平行β-折叠和13个loop环组成(图1)，含有两个二硫键(Cys64-Cys108、Cys156-Cys164)。CoTI的抑制中心环位于β4与β5之间，活性基序为L84-V85-R86-P87-T88，在与靶蛋白酶反应时，该Loop可能插入到胰蛋白酶的底物口袋中，从而发挥抑制作用。CoTI形成β-三叶草结构，12个反向平行β-折叠中的6个形成底部的β-桶(β-Barrel)，其余6个β-折叠形成疏水核心顶部的盖子(Lid)。Kunitz丝氨酸蛋白酶抑制剂β桶蛋白疏水核心的包装是家族特异性的。CoTI的Trp114残基位于桶盖连接处。通过与其他Kunitz丝氨酸蛋白酶抑制剂序列(ECTI[10]、STI[11]、DE-3[12]、DrTI[13]、TKI[14]、WCI[15]、BASI[16])比对可以看出，该残基在其他Kunitz蛋白酶抑制剂家族成员也高度保守(图3)。并且，将CoTI模型和其他Kunitz丝氨酸蛋白酶抑制剂的三维结构重叠比对，也可以看到Trp114在三维结构上高度重叠。

★为保守的W114

通过分析CoTI的W114发现，CoTI中的W114位于LID的β6折叠始端，与Leu98和Ser137形成氢键，其侧链伸向Barrel，与Leu42、Val68、Leu98、Phe100、Val126、Met127、Leu128、Phe139、Leu153和Val179形成疏水作用，从而参与三叶草结构的包装并决定结构的稳定性(图4)。

与W114形成疏水作用的氨基酸用灰色表示；与W114形成氢键的氨基酸用白色表示(Leu98与W114既形成氢键，又有疏水作用)；黑色虚线代表氢键

2.4 突变体活性检测

经检测，菜青虫中肠蛋白酶液的比活力为2.286 IU/mg，表明菜青虫中肠中含有胰蛋白酶。图5表明：CoTI对牛胰蛋白酶抑制效果显著，为204.92 UI/mg，而CoTI(W114A)突变体的抑制活力为74.97 UI/mg，相较于野生型CoTI下降了63.4%；CoTI对菜青虫中肠胰蛋白酶也具有明显的抑制活性，为167.728 6 UI/mg。而CoTI(W114A)突变体抑制活性下降了62%，仅为63.92 UI/mg。

2.5 突变体荧光光谱检测

蛋白质中的天然荧光生色团为其芳香族氨基酸(Trp、Tyr、Phe等)，其中由色氨酸残基发出的荧光占统治地位。通过对CoTI和突变体进行荧光光谱检测，由荧光光谱图(图6)分析可看出：CoTI(W114A)发生了轻微蓝移(342.8 nm蓝移至340.4 nm)，荧光强度由318.2减弱到216.2，减弱了32%，可能原因是114位的色氨酸突变为丙氨酸后，减少了蛋白质中的天然荧光发色团，故荧光强度降低，且发生突变后，疏水腔内相互作用力减小，使得三维结构更加紧凑。

图6 CoTI与突变体的荧光光谱

3 讨论与结论

尽管KPI家族成员的氨基酸序列保守性不高，但却具有相似的三级结构，可能原因是β折叠上的若干疏水氨基酸之间形成的分子间相互作用。通过同源建模方法，获得CoTI的三维模型，发现其三维模型为典型的β-三叶草结构，其中6个形成β-桶，另外6个形成封闭桶上方的盖子，此结构为β-三叶草结构蛋白质的常见基序。分析CoTI疏水核心，发现Trp114在Kunitz家族中是高度保守的，其位于β-桶与盖子的连接点处，不仅与Leu98和Ser137形成氢键，而且疏水侧链伸向β桶内部，与邻近的氨基酸Leu42、Val68、Leu98、Phe100、Val126、Met127、Leu128、Phe139、Leu153和Val179产生疏水作用。W114通过这些相互作用，紧紧地将盖子与桶的顶层缝合在一起，从而参与β-三叶草整体结构的维系并保持结构的稳定性。

向缅等[8]曾做过CoTI(R86D)突变体的表达及活性检测，结果相较于野生型，突变体对胰蛋白酶抑制活性下降了93%，从而证实Arg86为CoTI抑制胰蛋白酶的关键残基，且在发挥抑制作用的过程中起决定性的作用。而本实验通过对CoTI中W114进行单定点突变后发现：无论是对牛胰蛋白酶还是菜青虫中肠胰蛋白酶的抑制活性，突变体较野生型都发生明显下降，但抑制活性下降并没有CoTI(R86D)大，可能原因是Arg86作为CoTI与胰蛋白酶作用的关键残基，对发挥抑制作用至关重要，而W114则主要是作为维持蛋白质三维结构的关键残基，间接的影响抑制作用的发挥。荧光光谱检测发现，W114作为疏水腔内关键的氨基酸，当发生突变后，会使CoTI的整体构象发生改变。我们推测：Trp114残基突变为Ala残基后，原有的氢键与疏水作用随即减弱，甚至消失，会使整体结构趋于不稳定，进而影响抑制中心的构象，导致W114A突变体与靶蛋白酶的结合变弱，从而导致抑制活性的下降。研究证实W114是CoTI疏水核心中的一个关键残基，其在CoTI蛋白的折叠形成过程以及发挥抑制活性中起到了重要的作用，该结果为CoTI的结构功能研究及相关的应用奠定了理论基础。