信号素蛋白4D/丛蛋白B1通道参与动脉粥样硬化形成的研究进展

黄 菊，王立平，杨昆鹏，陈冬雪，赵 鹃*

(1.哈尔滨医科大学附属第一医院 心内科,黑龙江 哈尔滨150001;2.中国人民大学医院 放射科,北京100872)

动脉粥样硬化(AS)导致的急慢性心血管事件死亡率占居民疾病死亡构成的40%以上，位居第一，据估计我国心血管病现患人数约2.9亿人，已成为重大公共卫生问题[1]。信号素蛋白4D(Sema4D)因参与轴突生长调控而被发现[2]，近年来发现Sema4D及其受体丛蛋白B1(PlexinB1)均可在AS斑块中表达[3]，但对AS具体影响机制尚不明确，本文整合近年来文献，通过对其结构、特点、功能等进行分析，探讨Sema4D/PlexinB1通路的作用机制，阐明其在AS发生发展过程中的生理学意义。

1 Sema4D蛋白结构与分布

信号素蛋白(Semaphorins)家族是一类以结构中具有Sema区域为共同特征的蛋白，在人和病毒的鉴定中，Semaphorins家族有超过30个组成成员，根据结构与功能分为8个亚类[4]；Sema4D(CD100)属于IV类Semaphorins家族成员，是以同源二聚体模式存在于细胞膜的一种Ⅰ型跨膜糖蛋白[5-6]，非还原模式下分子量300 kDa,还原模式下150 kDa。

Sema4D蛋白组成包括：胞外N末端、Sema结构域、半胱氨酸富集区域(CRD)、免疫球蛋白样结构域(Ig)以及胞浆内的尾部结构，胞外部分还包括多个N-连接糖基化位点，用于形成亚基内二硫键[7]；Sema4D主要分为膜结合型和可溶性两种模式[5]，膜结合型Sema4D胞内部分存在1个蛋白水解位点[8]，当T细胞或血小板被激活时，Sema4D被金属蛋白酶ADAM17(TACE)水解，从细胞表面脱落从而产生具有活性的可溶性Sema4D(sSema4D)外域片段，其分子量非还原模式下240 kDa，还原模式下120 kDa，该片段可结合并激活其受体并保留在循环系统中[6-7]。

Sema4D分布广泛，在T细胞、B细胞、NK细胞、单核巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞、血小板表面等均有表达，静息的淋巴细胞表面的Sema4D可在细胞活化后表达增加，除此之外多种肿瘤的细胞系也可表达Sema4D，并可以自分泌形式分泌于肿瘤微环境发挥作用[7]；Sema4D最初因作用于神经系统中诱导轴突生长，参与神经元网络构建而被发现，随着研究深入发现Sema4D在肿瘤侵袭、免疫反应、细胞迁移、血管生成等过程中也起着关键作用[2，9-11]；最近的一研究表明，Sema4D在人AS斑块中表达，尤其是在巨噬细胞和泡沫细胞中表达，这揭示出Sema4D可能参与内皮功能障碍、脂质成分沉积等从而影响AS的发生与发展[3]。

2 PlexinB1蛋白结构与分布

PlexinB1是Plexins蛋白家族的一员，全长2 135氨基酸，其蛋白组成包括：胞外Sema结构域，3个PSI结构域，3个甘氨酸-脯氨酸(G-P)富集结构域，胞浆部分含有2个GAP(GTP酶活化蛋白)样结构域，中间1个GTP酶(GTPase)结合结构域，胞质尾部有一个盘状同源区域(PDZ)结合位点[8]。

PlexinB1是Sema4D的高亲和力受体，最初发现于小鼠肾脏源性细胞[6]，其mRNA转录本在肾、甲状腺、前列腺、脑、肺、乳腺、子宫、卵巢和肝脏等多种组织中均有一定水平的表达[12]；Basile等人发现PlexinB1在人和猪的内皮细胞高度表达，推测PlexinB1在AS形成过程中有着重要作用，两者构成的Sema4D/PlexinB1通路也受到广泛谈论[13]。

3 Sema4D/PlexinB通路信号转导途径

Yoshida[6]等研究人员发现Sema4D二聚体分别独立地结合到2个PlexinB1分子进行下游信号转导并激活以下3条信号通路发生作用：①PlexinB1募集并激活MET(也称C-Met)后，酪氨酸激酶导致MET及PlexinB1胞质区域部分磷酸化，从而参与血管生成等过程[13]；②募集并顺序激活PYK2及Src后，可直接激活PI3K/Akt进行作用，或由PYK2协助促进PlexinB1蛋白C端与RhoGEF蛋白亚组的PDZ区域结合活化RhoGTP酶(RhoA)，激活或抑制GDP向GTP转化，活化Rho并作用于下游分子ROCK和(或)mDIA1，诱导肌动蛋白丝延长进而实现细胞骨架的调控[13]；③PlexinB1的GAP区域活化后激活GTPase结构域，导致Ras蛋白(R-Ras)去磷酸化后短暂失活，进而参与下游信号转导[14]。

4 Sema4D/PlexinB1通路与AS的形成与进展

AS是一种多危险因素共同作用导致的慢性疾病。Yukawa等研究人员通过实验发现敲除载脂蛋白E缺陷型(ApoE-/-)小鼠中Sema4D基因可延缓AS的形成与进展，推测Sema4D可能通过参与内皮细胞损伤、单核细胞粘附迁移及其衍生的脂质负载的泡沫细胞形成，从而促进血管生成加剧AS斑块不稳定性[15]。

4.1 血管内皮损伤

4.1.1影响血管内皮结构的完整性

血管内皮钙黏蛋白(VE-cad)是位于内皮细胞粘附区的跨膜钙粘蛋白，它在维持内皮细胞完整性、血管通透性和血管内环境的稳定性中起重要作用，血管生成过程中，内皮细胞观察到的第1个变化即与β连环蛋白(β-catenin)有关的基于VE-cad改变造成的细胞间连接的破坏；Chen等[11]研究者在实验中发现敲低Sema4D和PlexinB1可以抑制VE-cad表达，并观察到细胞间连接被破坏；Yamamoto[17]等研究人员则在使用Sema4D刺激内皮细胞后观察到β-catenin从细胞与细胞间接触快速定位到细胞质中，导致基于VE-cad的内皮细胞收缩、细胞间裂隙形成，进而影响血管内皮通透性[8,16,17-18]。

4.1.2影响血管内皮功能的稳定性

一氧化氮(NO)是控制血管舒张的重要介质，且能借助其强脂溶性的特点，迅速扩散至血液，降低血小板活性及炎症因子的表达，抑制血小板凝集和炎症细胞向内皮细胞的粘附；而Sema4D可以通过PlexinB1途径激活小胶质细胞表达诱导型一氧化氮合酶(iNOS)促使血管内皮细胞NO合成增加，提示Sema4D可能参与AS的形成发展[19-20]。

4.2 参与炎症反应

AS的特征在于血管内膜中单核细胞和巨噬细胞蓄积,血管内膜中单核细胞水平可以评价临床心血管疾病严重程度[21]；Luque等[3]研究人员通过实验证实plexinB1在人单核细胞、巨噬细胞和泡沫细胞中表达，并作为单核细胞与内皮细胞(EC)耦合中促进细胞间接触的多种粘附分子的一部分，介导了血液单核细胞内皮粘附及其向内皮下空间的迁移，由此推测阻断Sema4D/PlexinB1通路可能有助于延缓单核细胞以及巨噬细胞的迁移并减少LDL的内皮下沉积[3]，从而延缓AS发生发展。Yoshida等[6]研究者通过研究发现sSema4D另一个重要的作用是可以诱导肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)的活化从而参与炎症反应。有人发现sSema4D刺激的单核细胞表达更高水平的CD163，这表明sSema4D可能诱导单核细胞向M2样表型极化，通过改变巨噬细胞的分化和表型，进而参与炎症反应影响AS的发生发展[22]。

有研究者通过噬菌体展示实验观察到Sema4D/PlexinB1通路还可下调巨噬细胞表面清道夫受体脂肪酸转位酶(CD36)，减少氧化低密度脂蛋白(oxLDL-C)与巨噬细胞结合，泡沫细胞生成减少[4，22-23]，提示Sema4D/PlexinB1通路可能存在一种特殊的抗AS作用。

4.3 参与AS斑块内血管新生

斑块内微血管新生可导致活性氧(ROS)产生和单核细胞浸润增加从而加速斑块生长并为单核细胞进入纤维帽加重斑块易损性创造了条件[8,11]；Sema4D能够通过介导内皮细胞迁移、管腔形成等促进血管发生。Chen[11]等在实验中发现敲低Sema4D和PlexinB1后可以抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中血小板内皮细胞粘附分子(CD31)，VE-cad和基质金属蛋白酶2(MMP2)的表达，其中CD31是内皮细胞的生物标记，VE-cad是血管生成的起始要素，MMP2亦是血管生成所必需的[3]，证明了Sema4D具有促进血管生成的作用，并且有实验证实Sema4D在体内外具有的血管生成作用不受其他血管生长因子上调介导[11，14]。

4.3.1诱导血管内皮形态发生和骨架重组

Conrotto等[8]认为MET介导的上皮细胞和内皮细胞募集作用，对促进血管形成有重要作用；实验证实Sema4D在与PlexinB1结合后，通过募集并激活MET磷酸化可以促进毛细血管样管的形成，同时在体外发芽实验中发现Sema4D也可以引起HUVEC椭球形成大量萌芽；Sema4D/PlexinB1通路还可以诱导细胞骨架重组，通过激活Rho及一系列反应触及肌球蛋白轻链磷酸化引起肌动蛋白应力纤维聚合，进而促进血管形成[15-18]。

4.3.2血管内皮细胞运动的发生

Chen[11]等研究者在transwell迁移分析实验中发现当Sema4D在HUVEC中被敲低时，迁移减少了约30%，表明Sema4D能够显著促进HUVEC的迁移；伤口愈合试验通过在内皮单层测量跨内皮电压(TEER)也表明在体外重组的Sema4D以剂量依赖形式促进内皮细胞迁移[18]。

Wu[18]等研究者通过使用慢病毒介导破坏内皮细胞中PlexinB1的CRISPR/Cas9基因，发现PlexinB1表达的降低显著阻断了刺激作用下Sema4D对内皮细胞迁移的影响，这表明Sema4D通过PlexinB1通路发挥促进内皮细胞迁移的作用[15]。除Sema4D对PlexinB1的直接作用外，Sema4D/PlexinB1通路还可以通过募集并激活MET来促进内皮细胞迁移[24-26]。

4.4 血小板粘附微血栓形成

Sema4D表达缺失可通过降低血小板对血管损伤的反应，降低高血脂状态下血小板高反应性，进而减少血栓的大小和闭塞的频率[18]；Mou[27]发现缺乏Sema4D的小鼠在体内血管损伤后表现出延迟的动脉闭塞，证明了Sema4D可以影响血管微血栓形成；Sema4D介导的血小板活化聚集存在双重机制，由于血小板既能表达Sema4D又能表达PlexinB1，所以最初附着在血小板表面的Sema4D可以充当血小板与血小板之间相互作用的配体进行初始化偶联[9]，通过依赖于接触的方式增加脾酪氨酸激酶(Syk)的活化来促进胶原诱导的血小板活化，从而促进血栓形成，随着Sema4D在TACE介导下从血小板表面脱落，接触增强作用减弱，Syk活化遭受抑制，从而抑制血小板聚集及血栓生长[27-29]。

5 抗Sema4D靶向治疗方案

Sema4D最近被评估为炎性疾病和癌症治疗的靶标，目前，已经通过使用识别鼠、灵长类和人Sema4D分子的杂交瘤开发了人源化IgG4抗Sema4D抗体(名为VX15/2503)，Ⅰ期临床试验中表现出良好的治疗耐受性；在向玻璃体内注射抗Sema4D抗体的实验中发现：sSema4D可以诱导周细胞迁移和N-钙粘着蛋白(CDH2)内在化，降低血管内皮覆盖率增加血管通透性，从而影响内皮细胞功能[18]。在风湿性关节炎小鼠模型中，抗Sema4D治疗的小鼠的疾病评分显著降低，显示出滑膜中炎性浸润的减少以及较低的TNF-α和IL-6血清水平，此外，炎症部位的血管生成也较少。这些实验结果都表明抗Sema4D治疗可以作为风湿性关节炎、AS等慢性炎症疾病的新型治疗策略[30-31]。

6 总结与展望

目前大多数流行的AS疗法都仅针对传统的危险因素而非AS本身，干预Sema4D/PlexinB1通路可能为AS引发的心血管事件诊疗提供新思路，若针对AS进行防治，抑制血小板活化、内皮细胞功能障碍及泡沫细胞形成，或可防止冠状动脉粥样硬化进一步恶化；从Sema4D等新型蛋白分子入手，深入研究其对AS发生发展的影响，也可以为心血管事件发生提供更高预测价值的靶点。