Ghrelin对心衰心肌纤维化的影响及机制研究

杨春艳,闫晓雨,贺玉泉，杨 萍

(吉林大学中日联谊医院 心内科,吉林 长春130033)

心力衰竭(HF)简称心衰，是各种心血管疾病的终末阶段，具有发病率高、再入院率高、死亡率高的特点[1]。心肌重构是心衰进展的重要因素，而心肌纤维化是促进心肌重构的关键因素[2-3]。因此，如何成功调控心肌纤维化过程，消除心肌纤维化的诱因、抑制或阻断心肌纤维化的信号传通通路有望成为治疗心力衰竭的新靶点。Ghrelin是由日本科学家Kojima等于1999年从大鼠胃中提纯出的含28个氨基酸的活性多肽，是生长激素促分泌素受体(GHS-R)的内源性配体，具有多种生物学活性[4]。Ghrelin及其受体广泛存在于心血管系统[5]，提示Ghrelin在心肌可能具有旁分泌或自分泌功能，从而发挥相应的心血管效应。以往的研究表明，Ghrelin对心力衰竭具有一定的治疗作用，但其具体机制仍有待进一步揭示。本研究旨在探讨对心梗后心衰心肌纤维化的影响及其可能机制，为Ghrelin应用于临床治疗心力衰竭提供实验依据。

1.1 动物本研究应用的是由吉林大学基础医学院动物实验中心提供的体重200-220 g的雌性Wistar大鼠，合格证号：SCXK-(吉)2003-0001。

1.2 主要试剂酰基化Ghrelin购自于中肽生物科技有限公司，HE染色试剂盒购自碧云天生物技术公司，Masson染色试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司，PCR试剂购自上海生物工程技术有限公司，免疫组化试剂购自于北京中衫金桥生物技术有限公司。

1.3 大鼠心衰模型制备及分组大鼠适应性饲养1周后，随机分为模型组40只和假手术组(SO组)10只，模型动物行左冠状动脉前降支结扎术，方法如下：乙醚吸入麻醉，备皮，局部消毒，先用10号缝线在开胸部位做一荷包，迅速开胸暴露心脏，模型组用0号线结扎左冠状动脉前降支，假手术组仅穿线不结扎。术后迅速收拢荷包关闭胸腔，手术部位涂敷0.2%呋喃西林软膏，并常规给予腹腔注射青霉素(20万U/kg)7天。术后4周模型组存活大鼠20只，随机分为模型组(MI 组：皮下注射与Ghrelin等体积的0.9%生理盐水，2次/日)；模型-Ghrelin组(MI-Ghrelin 组：皮下注射Ghrelin 0.2 mg/kg，2次/日)。假手术组皮下注射与Ghrelin等体积的0.9%生理盐水，2次/日。所有实验大鼠药物干预4周后终止饲养进行实验。

1.4 心脏超声检测给药结束后，乙醚吸入麻醉后于左胸上至锁骨下至肋骨下缘处备皮，对大鼠射血分数(EF)进行检测。

1.5 HE染色切取非梗死区心室肌组织约2 mm厚，用4%多聚甲醛固定72 h，之后常规石蜡包埋，切片(5 μm厚)，二甲苯脱蜡，下行梯度酒精水化，按试剂盒说明书进行苏木素及伊红染色，于显微镜下观察染色程度。待染色结束后，上行梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜观察并拍照。

1.6 Masson染色石蜡切片脱蜡及水化方法同上，按试剂盒说明书进行苏木素及丽春红染色，磷钼酸处理约3 min，固绿染色液染色，分化，于显微镜下观察染色程度。待染色结束后，上行梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，染色结束后于暗室光镜下观察，肌肉为红色，胶原蛋白呈绿色。

1.7 免疫组织化学染色石蜡切片脱蜡及水化方法同上，按试剂盒说明书进行免疫组化染色。大致方法如下：3%H2O2孵育，PBS浸泡，山羊血清封闭，加一抗(1∶500倍稀释)4℃ 过夜，PBS冲洗，滴加生物素标记二抗，PBS冲洗，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，PBS冲洗，DAB显色剂显色，自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

1.8 RT-PCR检测Ⅰ、Ⅲ型胶原及Act A的mRNA表达提取总RNA及逆转录反应：Trizols提取各组H9c2细胞的总RNA，分光光度计测定RNA的浓度和纯度，然后取2 μg RNA进行逆转录,合成cDNA后扩增30个循环。所有引物均由上海生物工程技术有限公司合成,序列见表1。

表1 RT-PCR引物合成表

2 结果

2.1 心功能相关指标检测心脏超声检查结果显示：MI组大鼠心脏射血分数(EF)值较SO组明显降低，有显著性差异(P<0.01)；MI-Ghrelin组大鼠EF较MI组明显增加，有显著性差异(P<0.01)，见图1。

图1 心脏超声检查

2.2 心肌组织形态学检查为明确心肌组织形态学改变，行HE染色检查。结果如下：SO组可见心肌纤维排列整齐，心肌纤维结构清晰；MI组心肌纤维部分断裂，肌纤维形态极不规则，排列紊乱，可见大量纤维组织增生。Ghrelin治疗组与MI组比较，可见断裂心肌纤维减少，肌纤维排列较整齐，炎细胞浸润及纤维化程度明显减轻，见图2。

图2 HE染色法检测大鼠心肌组织病理学改变(×200)

2.3 心肌纤维化水平检测为明确Ghrelin改善心梗后心衰大鼠心功能的机制，应用Masson染色检测各组大鼠心肌纤维化水平。结果发现：MI组大鼠心肌纤维化程度较SO组明显增加；给予Ghrelin干预后，心衰大鼠心肌心肌纤维化程度较模型组明显降低。见图3。

图3 HE染色法检测大鼠心肌组织病理学改变(×200)

进一步应用RT-PCR法检测Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA表达，结果发现：与假手术组相比，模型组大鼠心肌组织Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA表达明显增加，有显著性差异(P<0.01)；给予Ghrelin治疗后，Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA表达明显减少，有显著性差异(P<0.01)。上述结果提示：Ghrelin可能通过抑制心梗后心肌纤维化，进而改善心梗后心功能。

2.4 心肌组织Act A及其受体ActRIIA表达水平检测为进一步探讨Ghrelin抑制心肌纤维化的机制，研究还检测了各组大鼠心肌组织Act A及其受体ActRIIA表达水平。结果发现：与假手术组相比，模型组大鼠心肌组织Act A及ActRIIA 表达明显增加；而给予Ghrelin治疗后Act A及ActRIIA 表达明显减少。见图4至图6。上述结果提示：Ghrelin可能通过下调Act A及其受体ActRIIA表达，减少或部分阻断Act A的作用，进而抑制心肌纤维化，改善心功能。

图4 RT-PCR检测Ⅰ型及Ⅲ型胶原 mRNA表达

图5 RT-PCR检测Act A mRNA表达

图6 免疫组化染色检测ActRIIA表达(×200)

3 讨论

目前，现有的抗心衰药物尚不能从根本上改善心衰预后，延缓心衰进展，因此寻找新的改善心衰症状、阻止或延缓心衰病理进程、延长患者生存率的有效药物为当务之急。Ghrelin是由日本科学家Kojima等于1999年从大鼠胃中提纯出的含28个氨基酸的活性多肽，除刺激生长激素分泌、调节摄食及促进新陈代谢外，尚具有许多心血管保护作用，尤其是其抗心衰作用越来越获得人们的关注[6-7]。然而，Ghrelin发挥抗心衰作用的相关分子机制尚未完全明确。因此，我们构建心梗后心衰大鼠模型，旨在探讨Ghrelin对心梗后心肌纤维化的影响及其可能机制。

胶原是心肌纤维化的重要组成物质，与心肌纤维化程度密切相关。心脏成纤维细胞约占心肌总细胞的2/3，是细胞外基质的主要组成部分，在心脏重塑过程中起着关键作用。在心肌纤维化过程中，心脏成纤维细胞在受到各种信号因子的刺激下分化成为肌样成纤维细胞，可以高度增殖、收缩、迁移并合成及分泌胶原[8]。在心脏疾病的早期，胶原的合成及沉积能加强局部的收缩力，形成瘢痕防止心脏破裂并改善心功能[9]；然而在心脏疾病的后期，过度的胶原沉积则会引起心肌僵硬度增加、顺应性下降，心脏收缩舒张能力下降，最终导致心力衰竭[10]。为进一步明确Ghrelin对心肌纤维化的影响，本研究采用Masson染色检测心肌纤维化程度，并用RT-PCR法检测Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA表达情况，结果发现MI组心肌纤维化程度重，Ⅰ型及Ⅲ型胶原 mRNA表达水平明显增加；而Ghrelin组心肌纤维化程度明显减轻，Ⅰ型及Ⅲ型胶原表达明显减少。进一步证实Ghrelin可通过下调Ⅰ型及Ⅲ型胶原表达抑制心肌纤维化，进而改善心功能。

激活素A(Activin A，Act A)是转化生长因子(TGF)-β超家族成员，具有广泛的解剖学分布及生物学功能，包括：组织修复、细胞增殖、凋亡、胚胎发生及炎症[11]。以往的研究表明：心衰时Act A异常表达，与心肌重构密切相关。早在2004年Yndestad等就发现心力衰竭(心功能分级Ⅱ-Ⅳ级)患者血清Act A水平升高，并与心衰严重程度呈正相关[12]。Hu等2018年的研究发现Act A抑制可减轻心衰大鼠心肌梗死后交感神经重构[13]。本研究亦发现Act A与心肌纤维化密切相关，Act A可促进心肌成纤维细胞增殖及胶原蛋白表达[14]。本研究应用PCR检测Act A mRNA表达，结果发现Ghrelin可明显抑制心梗后心衰大鼠心肌组织mRNA表达。上述结果提示：Ghrelin可能通过下调Act A抑制心梗后心衰心肌纤维化。

激活素通过其受体发挥生物学作用，激活素受体(ActR)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶型受体。包括ActRⅠ和ActRⅡ，ActRⅠ分ⅠA与ⅠB，ActRⅡ有ⅡA(ActRⅡA)和ⅡB(ActRⅡB)型。激活素首先与细胞外的Ⅱ型受体(ActRII)结合，再招募Ⅰ型受体(ActRI)，并使后者活化，传导信号入细胞内[15]。为探讨Ghrlein对Act A信号通路的影响，本研究还应用免疫组化染色法检测了ActRⅡA的表达水平，结果发现MI组ActRⅡA表达水平明显增加；而Ghrelin组ActRⅡA表达明显减少。上述结果提示，Ghrelin既可下调Act A表达，又通过抑制其受体ActRⅡA表达部分阻断Act A的作用通路，发挥抗心肌纤维化作用。

综上所述，我们目前的研究不仅明确了Ghrelin 可抑制心梗后心衰心肌纤维化，更重要的是，明确了Ghrelin 抑制心梗后心衰心肌纤维化的可能机制，Ghrelin可通过下调Act A及其受体ActRIIA，进而影响心肌纤维化相关分子Ⅰ型及Ⅲ型胶原的表达，进而延缓或抑制心肌纤维化进展，改善心功能。