人胃癌耐药细胞的建立方法及意义

刘玉侠，齐 红，段北野，付 尧，夏 莉，于 鸿，王 斌*

(1.吉林省肿瘤防治研究所,吉林 长春130012;2.吉林省肿瘤医院；3.吉林省人民医院)

胃癌是消化道恶性肿瘤之一，在我国发病率和死亡率均较高[1-2]。目前胃癌的治疗还是以手术为主，辅以术后化疗及靶向治疗。在化疗过程中，很多人会对化疗药物产生耐药，从而影响治疗效果。为了探求肿瘤细胞的耐药机制以及为耐药肿瘤治疗的研究提供实验模型，本实验采用顺铂反复冲击的方法建立人胃癌细胞SGC-7901耐药细胞模型，为研究化疗耐药机制及治疗等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂及器材IMDM培养基，Gibco产品；DMEM培养基，Hyclon产品;MTT(噻唑蓝)，Sigma产品；胎牛血清，天津TB公司；DMSO(二甲基亚砜)，Sigma产品；顺铂，江苏豪森药业股份有限公司；琼脂糖，DNA标准品，宝泰克公司产品；低温低速离心机，SORVALL RTT USA；全自动酶标仪，Labsystems Dragon；电泳仪,上海天能。

1.2人胃癌细胞株SGC-7901,吉林省肿瘤防治研究所保存。

1.3 实验方法

1.3.1培养人胃癌细胞株SGC-7901 将液氮冻存的SGC-7901细胞取出复苏后，离心洗涤，加入含10%FCS的DMEM培养液的培养瓶中，置于37℃,5%CO2培养箱饱和湿度下培养。

1.3.2诱导SGC-7901细胞耐药 SGC-7901细胞培养至指数生长期，加入终浓度为50 μmol/L顺铂，冲击1 h后弃去含顺铂培养基，更换为新鲜配制的含10%FCS的DMDM培养液继续培养，每天观察细胞生长状态，待细胞长满时，用0.25%胰酶消化传代。传代后细胞长满瓶底时用同样浓度的顺铂同样方法冲击.如此反复，体外连续培养、冲击、传代，并反复冻存，复苏，观察细胞株生长稳定性，同时进行抗药性检测。

1.3.3细胞抗药性(抑制率)检测 用MTT法将培养的人胃癌细胞株SGC-7901和经过顺铂冲击处理4次和6次的SGC-7901细胞培养至对数生长期，0.25%胰酶消化后，洗涤、计数、重悬于10%FCS的DMDM培养液，调整细胞密度为5×104/mL，加入96孔培养板，100 μL/孔，37℃,5%CO2培养箱过夜培养，细胞贴壁后加入顺铂，终浓度分别为100、50、25、12.5、6.25 μmol/L，同时设阴性对照(等体积的生理盐水)和空白对照(无细胞)。各组设6复孔。37℃,5%CO2培养箱继续培养48 h，培养结束前4 h加入MTT(5 mg/mL)，20 μL/孔待培养结束，小心吸弃培养上清，每孔加入DMSO，150 μL，震荡溶解后，用全自动酶标仪检测各孔吸光度值(A)，波长为492 nm。根据检测结果计算耐药性(抑制率)及IC50(50%细胞生长抑制所需的药物浓度)，计算方法：抑制率=[1-(实验组均值/阴性对照组均值)]×100%，应用SPSS17.0软件计算。

1.3.4SGC-7901细胞(对照组及实验组)DNA提取 见参考文献[3]。

1.3.5SGC-7901细胞(对照组及实验组)多药耐药基因(MDR)及特异性基因片段扩增及检测 (1)MDR基因全长扩增、检测：取1.3.4提取的DNA，采用PCR扩增、琼脂糖电泳法检测MDR全长序列(约4.7 kb)的表达。引物设计：上游引物 ATGGATCTTGAAGGGGACCGCAATGGAGG，下游引物CATCTCATACAGTCAGAGTTCACTGGCGC。扩增方法和条件：在离心管内加入下列物质：10x bf，2.5 μL；MgCl2，2.5 μL；DNTP(2 mM)，1.0 μL；Primers，1.0 μL(each)；DDW，16.0 μL；Target，1.0 μL；95℃,5 min；Tag，0.5 μL；94℃，60 s；55℃，80 s；72℃，150 s；共30个循环,72℃延伸10 min。用0.8%的琼脂糖进行凝胶电泳。(2)MDR特异基因片段(约162 bp)检测：DNA提取方法同上。引物设计：上游引物CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG，下游引物：GTT CAA ACT TCT GCT CCT GA。扩增方法：在离心管内加入下列内容物：10x bf 2.5 μL，MgCl2 2.5 μL，DNTP(2 mM)2.5 μL,Primers 1.0 μL(each)，DDW 14.0 μL，Target 2.0 μL，95℃,5 min；Tag 0.5 μL，94℃ 30 s，55℃ 60 s，72℃ 70 s，共30个循环,每个循环增加1 s,720C延伸10 min。用1.5%的琼脂糖进行凝胶电泳。

1.4 统计分析应用SPSS17.0统计学软件进行分析，计量数据采用Mean±SD表示，组间比较采用方差分析及t检验进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同次数顺铂冲击后细胞耐药性检测及IC50测定结果

2.1.150 μmol/L顺铂冲击4次后不同浓度顺铂对亲本细胞和耐药诱导细胞的生长抑制情况及IC50结果，见表1。

表1 正常SGC-7901细胞和经5 0 μmol/L顺铂冲击4次后SGC-7901细胞的耐药检测

2.1.250 μmol/L顺铂冲击6次后不同浓度顺铂对亲本细胞和耐药诱导细胞的生长抑制情况及IC50结果，见表2。

表2 正常SGC-7901细胞和经5 0 μmol/L顺铂冲击6次后SGC-7901细胞的耐药检测

2.2 耐药SGC-7901细胞MDR及特异性片段表达检测

MDR1全长大约4.7 kb，从图1可以看出，在此位置上可见一泳带，证明提取胃癌细胞SGC-7901顺铂耐药细胞有MDR1基因的表达，而亲本SGC-7901细胞没有表达。

图1 耐药SGC-7901细胞MDR表达

MDR1特异片段大约167 bp，从图2电泳结果可见，在诱导4次和6次的耐药SGC-7901在167 bp附近有1条泳带，而亲本细胞没有表达。

图2 耐药SGC-7901细胞特异性片段表达

3 讨论

肿瘤细胞耐药是影响治疗效果的重要原因之一。肿瘤耐药的产生有多种原因，其中有原药耐药和多药耐药。原药耐药是指肿瘤细胞对已经用过的药物产生的耐药，而MDR是指肿瘤细胞对1种药物产生耐药后，对其他结构和功能以及作用机制不同的多种药物都产生了耐药。多药耐药大部分发生于单用高剂量给药或联合用药后存活下来的部分细胞[4-5]，也就是肿瘤干细胞(CSCs)。CSCs虽然仅占肿瘤细胞的一小部分，但它却有强大的自我更新能力，形成与亲代细胞完全相同的肿瘤细胞，是肿瘤复发的根源[6-7]。

目前，铂类药物是最常用的周期非特异性抗肿瘤药物，它是多种肿瘤治疗药物的首选。其中，顺铂(DDP)是使用广泛的化疗药物之一[8]。但是由于铂类抗肿瘤药物结构上的相似，使其很容易产生原药耐药或交叉耐药，造成化疗治疗的失败[9]。根据这一现象，本实验用顺铂诱导人胃癌细胞SGC-7901产生耐药性，建立人胃癌细胞SGC-7901顺铂耐药模型，为耐药细胞的治疗等研究提供实验基础。

本研究经过反复实验，最后选择用50 μmol/L顺铂对人胃癌细胞SGC-7901进行反复冲击的方法，诱导SGC-7901细胞耐药，并对冲击第4次和第6次的细胞以及亲本细胞分别做了耐药抑制率和耐药基因检测，以确认耐药相关，结果证明，经4次和6次冲击后，人胃癌细胞SGC-7901对顺铂具有较强的耐受力，IC50分别为63.98 μmol/L和66.34 μmol/L，而亲本细胞SGC-7901则分别为20.55 μmol/L和18.22 μmol/L，4次和6次冲击结果比较无论是对照组还是实验组没有明显差异，而同次间的比较有显著差异(P<0.01)，同时诱导4次和6次的SGC-7901细胞均有MDR和特异片段表达。因此，本实验建立了SGC-7901/DDP耐药细胞株。该细胞株通过反复冻存、复苏后，仍对顺铂有较高的耐药性及MDR的表达。