红景天甙调控sirt1/FOXO1通路改善酒精性肝损伤的实验研究

孙书林,吴发明,金锦莲

(国药葛洲坝中心医院,湖北 宜昌443000)

酒精性肝损伤(Alcoholic liver injury，ALI)指长期大量饮酒或短时间内摄入大量酒精而引起的肝脏疾病[1]。沉默信息调节因子1(Silent Information Regulator 1，sirt1)/叉头转录因子(Forkhead transcription factor，FOXO1)通路可调控氧化应激、炎症反应、脂代谢等病理过程，并参与ALI疾病发生[2]。故探究sirt1/FOXO1通路的调控作用，可能对阐明ALI病理机制具有一定临床意义。中药提取物红景天甙可抗肝纤维化具有保肝作用，且近来研究发现其可减轻ALI[3]。但红景天甙改善ALI具体分子生物学机制不甚明确。本研究推测红景天甙可能通过调控sirt1/FOXO1信号轴，改善酒精所致肝损伤，通过建立ALI大鼠模型，设置sirt1/FOXO1通路抑制剂对此进行验证，以期阐明ALI病理机制及红景天甙改善ALI分子生物学机制，为中药的推广及临床合理用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 大鼠ALI模型建立及分组给药

清洁级SD雄性大鼠，7-8周龄，体重200-220 g，50只，用随机数字表法分为正常对照组、ALI模型组、红景天甙(40 mg/kg)组、sirt1抑制剂(Tenovin-6)组(25 mg/kg)、红景天甙+sirt1抑制剂(红景天甙+Tenovin-6)组(40 mg/kg+25 mg/kg)，每组10只；除正常对照组大鼠灌胃给予生理盐水外，其余各组大鼠均参照文献[3]处理。各组大鼠均于造模同时进行干预治疗，即每天13:00开始给药，红景天甙组、Tenovin-6组及红景天甙+Tenovin-6组参照文献[3-4]设置剂量并按10 mL/kg剂量灌胃给药；正常对照组和模型组在相同时间按10 mL/kg的剂量灌胃给予生理盐水。于第4周末次给药后12 h取材进行后续试验。

1.2 检测方法

1.2.1大鼠一般行为观察

各组大鼠均于给药期间观察大鼠的精神状态及体质量等一般情况。

1.2.2大鼠肝功能指标检测及组织标本采集

取腹主动脉血，离心分离后取血清，检测血清甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平；置于-80℃冰箱保存，剩余肝组织置于4%多聚甲醛中备用。

1.2.3大鼠肝组织HE染色

取1.2.2项下4%多聚甲醛溶液中的肝组织，按HE试剂盒说明书操作，并在显微镜下观察肝组织变化。

1.2.4大鼠肝组织氧化应激指标SOD、MDA含量

取1.2.2项下-80℃保存的肝组织，解冻后用组织匀浆器匀浆、离心分离，按SOD、MDA试剂盒说明书中操作方法对肝组织中SOD、MDA水平进行检测。

1.2.5Western blot法检测肝组织sirt1、FOXO1、acFOXO1、AdipoR2、MTP蛋白相对表达水平

取1.2.2中-80℃保存的肝组织，解冻后用组织匀浆器(10%蛋白裂解液)匀浆、离心(12 000 rpm，4℃，15 min)分离，取上清液0.5 mL，用BCA法对蛋白总浓度进行检测后，取20 μg蛋白进行电泳(SDS-PAGE)分离及转膜(湿转法)、封闭(5%脱脂牛奶封闭1 h)后，加入一抗抗体(sirt1、FOXO1、acFOXO1、AdipoR2、MTP、β-actin(内参))抗体，稀释倍数分别为1∶1 000)，在4℃条件下孵育过夜，次日用TBST洗涤并加HRP标记的羊抗兔二抗(稀释倍数1∶1 000)，37℃条件下孵育1 h后，TBST洗涤3-4次后，采用增强化学发光法(滴加ECL发光液)显色，以化学发光仪拍照并观察条带灰度，以Image-J软件分析系统分析各组蛋白灰度值并进行计算。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠一般行为观察变化

正常对照组大鼠在造模过程和给药期间，饮食规律，皮毛色泽光亮，精神状态较好；模型组大鼠乙醇灌胃后出现精神兴奋、亢进，2 h后出现精神萎靡，2周后大鼠出现皮毛色泽变暗干枯、精神状态差、饮食减少、体重下降现象；红景天甙组大鼠一般情况均优于模型组；红景天甙+Tenovin-6组大鼠一般情况较红景天苷组差。

2.2 红景天甙组对大鼠肝功能指标TG、ALT、AST水平的影响

与正常对照组相比，模型组大鼠肝功能指标血清TG、ALT、AST水平升高；与模型组相比，红景天甙组大鼠肝功能指标呈降低趋势，Tenovin-6组呈升高趋势；红景天甙+Tenovin-6组趋势变化与红景天苷组相反(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清TG、ALT、AST水平比较

2.3 红景天苷对大鼠肝组织病理损伤的影响

正常对照组肝组织结构正常。模型组大鼠肝组织可见肝细胞水肿坏死、胞浆内脂肪空泡变性、及炎性细胞浸润及肝小叶内纤维化等病理损伤；与模型组相比，红景天甙组大鼠上述病理损伤减轻；Tenovin-6组病变加重。红景天甙+Tenovin-6组病变程度介于Tenovin-6组和红景天甙组之间，见图1。

图1 各组大鼠肝组织HE染色图(200×)

2.4 红景天苷对大鼠肝组织SOD、MDA水平的影响

与正常对照组相比，模型组大鼠肝组织MDA升高，SOD降低，氧化应激水平趋势升高；与模型组相比，红景天甙组肝组织氧化应激水平呈降低趋势；Tenovin-6组呈升高趋势；红景天甙+Tenovin-6组趋势变化与红景天苷组相反(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠肝组织SOD、MDA含量比较

2.5 红景天苷对大鼠肝组织sirt1、FOXO1、acFOXO1、AdipoR2、MTP蛋白表达的影响

与正常对照组相比，模型组大鼠肝组织sirt1、AdipoR2、MTP蛋白表达呈降低趋势，acFOXO1/FOXO1呈升高趋势；Tenovin-6组sirt1、AdipoR2、MTP变化趋势进一步降低，acFOXO1/FOXO1进一步升高；红景天甙组上述变化趋势与模型组相反；红景天甙+Tenovin-6组变化趋势与红景天苷组相反(P<0.05)。见图2。

图2 红景天苷对大鼠肝组织蛋白表达的影响

3 讨论

近年来，ALI患病率逐渐升高且已成为继病毒性肝炎之后的第二大肝病。乙醇在肝细胞微粒体代谢过程中产生的大量乙醛，是导致肝脏炎症反应及病理损伤的主要原因之一[5]。另外，当过量酒精刺激肝脏细胞，引起肝脏氧化应激损伤时，肝细胞胞浆及线粒体中转氨酶ALT及AST显著升高并释放到血液中，血清TG含量明显升高[6]。中药提取物红景天甙具有抗疲劳、抗衰老、抗缺氧、抗肝纤维化等多种药理作用[7]，且红景天甙能够通过减轻肝组织炎症、增加抗氧化酶活性、降低脂质过氧化，改善大鼠酒精性肝损伤病理变化[4]。本研究结果证实红景天甙具有改善ALI大鼠肝功能作用，然而具体分子生物学机制不甚明确，本研究对此进行探究，以期为红景天甙的开发应用提供试验依据。

乙醇代谢可致氧化型辅酶I与还原型辅酶I比例降低，进而抑制sirt1生物活性，加重肝脏损伤。sirt1通过调节FOXO1去乙酰化水平，进而调节细胞氧化应激、炎症、自噬及凋亡等多种生理过程，还可与AdipoR2启动子结合，调节脂质代谢和抵抗氧化应激，减少肝脏脂质沉积并阻止脂肪肝发生。MTP为重要的脂质蛋白，可与载脂蛋白结合，将含脂蛋白以低密度脂蛋白-甘油三酯的形式转运出肝脏[8]，而FOXO1可直接刺激MTP活性，参与脂质代谢过程。本研究推测乙醇可抑制sirt1活性，抑制FOXO1去乙酰化水平，使得肝组织中acFOXO1较高，进而引起下游调节蛋白AdipoR2、MTP表达降低，导致肝细胞脂质代谢紊乱和脂质堆积，可能是ALI病理损伤的机制之一。结果提示红景天甙可能通过激活sirt1表达，抑制FOXO1乙酰化水平，激活FOXO1去乙酰化水平，降低肝脏脂质代谢紊乱和脂质堆积。为了验证这一推测，本研究设置sirt1通路抑制剂Tenovin-6进行验证，表明Tenovin-6可逆转红景天甙改善ALI大鼠肝脏损伤的作用。

综上所述，红景天甙可通过激活sirt1/FOXO1/AdipoR2/MTP通路，改善肝脏脂质代谢，减轻脂质堆积，保护ALI大鼠肝功能，可能为阐明红景天甙在改善ALI进程中作用提供一定参考，但sirt1/FOXO1通路下游靶分子较多，红景天甙也可能通过sirt1/FOXO1通路调控炎症和自噬来缓解ALI，这需要后续继续深入研究。