CYP27A1抑制膀胱癌细胞增殖及作用机制研究

景中民，朱海松，徐海亮，张 超

(驻马店市中心医院 泌尿外科,河南 驻马店463000)

膀胱癌是泌尿生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一，男性膀胱癌的发病率为女性的3-4倍[1-2]。雄激素受体(AR)是雄激素配体调节的转录因子，雄激素-AR信号通路在膀胱癌的发生发展中起重要作用，这可能是膀胱癌发病率性别差异的原因[3-4]。线粒体胆固醇27-羟化酶(CYP27A1)，是细胞色素P450氧化酶家族的一员，可将胆固醇转化为27-羟基胆固醇(27-HC)。CYP27A1的表达与多种肿瘤的增殖相关，例如前列腺癌、乳腺癌和结直肠癌[5-7]。此外，27-HC作为胆固醇代谢物，是一种选择性的雌激素受体调节剂，调节体内胆固醇平衡并进一步影响细胞增殖[8]。在乳腺癌中，27-HC作为雌激素受体(ER)调节剂被首次发现，可以激活ERs和增加ER(+)乳腺癌细胞增殖[9-10]。然而，在前列腺癌中，27-HC对细胞增殖的影响是有争议的。有报道在前列腺上皮细胞中27-HC促进了未转化细胞的增殖与ER和AR相关[11]。CYP27A1在膀胱癌中的表达水平和CYP27A1/27-HC与膀胱癌增殖之间的关系尚未明确。因此，本文研究CYP27A1对膀胱癌细胞增殖的影响及具体的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞系 T24、5637和293T细胞系购于中国医学科学院基础医学院细胞资源中心，细胞培养在含有10%胎牛血清(Gibco公司，美国)和1%青霉素/链霉素(碧云天生物技术研究所，江苏)的DMEM培养基(Gibco公司，美国)中，放置37℃，含有5%CO2的恒温箱中培养。

1.1.2试剂 总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒购于日本TaKaRa公司；BCA蛋白定量试剂盒购于碧云天生物技术有限公司；CYP27A1、β-actin单克隆抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG抗体购于美国Cell Signaling Technology公司；噻唑蓝(MTT)粉末和二甲基亚砜(DMSO)购于北京索莱宝公司；CYP27A1-pcDNA3.1由苏州金唯智生物科技有限公司合成；CYP27A1/27-HC购于美国圣克鲁斯生物有限公司；检测27-HC的ELISA试剂盒购于上海泽叶生物技术有限公司；BALB/c裸鼠购于北京维通利华公司。

1.2 实验方法

1.2.1稳定细胞系的构建 CYP27A1-pcDNA3.1插入质粒pLVX-IRES-Puro中，采用分子生物学技术获得质粒CYP27A1-pLVX-IRES-Puro。pLenti pLVX-IRES-Puro载体(1 μg)或pLenti CYP27A1-pLVX-IRES-Puro(1 μg)与psPAX2(1 μg)和pMD2.G载体(0.5μg)共转染，加入293T细胞中并进一步培养。细胞培养48 h后，收集病毒上清液，以1 500 rpm离心5 min。在病毒上清液中加入8 μg/ml聚凝胺，然后转染至T24细胞。转染24 h后，用2 μg/ml嘌呤霉素选择过表达CYP27A1-或pLVX-细胞，产生稳定的细胞系T24-CYP27A1和T24-pLVX(T24-Control)。

1.2.2qRT-PCR 根据试剂盒说明书提取细胞中总RNA，反转录为cDNA，按照SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明进行实时定量PCR。每种基因的表达变化用 ΔΔCt 法计算，以管家基因 GAPDH的 mRNA 水平作为内参照。引物设计如下：CYP27A1上游引物序列5′-AGCTGCGCTTCTTCTTTC AG-3′，下游引物序列5′-GCTCCATGTCGTTCCGTA CT-3′，AR上游引物序列5′-AAGGCTATGAAT GTCAGC CCA-3′，下游引物序列5′-CATTGAGGCTAGAGAGCAAGGC-3′。引物由北京华大基因有限公司合成。

1.2.3Western blot实验 提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术有限公司)定取30 μg蛋白。制作10%的分离胶和5%的浓缩胶，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白转至PVDF膜上。切取目的蛋白，用5%脱脂奶粉封闭、一抗过夜孵育、TBST溶液清洗3遍、二抗室温孵育1 h、TBST溶液清洗3遍。配置一定量的显影液，均匀滴加在膜上，至于Amersham Imager600凝胶成像系统中拍照。

1.2.4MTT实验 采用不同的处理方式，处理细胞后检测细胞的增殖情况。每个处理组设置6个平行孔，20 μl MTT溶液加入检测孔中，继续孵育4 h。然后去除上清，每孔加入150 μl DMSO，震荡5 min然后用酶标仪检测570 nm处的吸光度值(OD)。

1.2.5裸鼠移植瘤模型 14只雌性BALB/c裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，6-8周龄，待其体重平均增至20 g时，随机分成两组。收集T24-CYP27A1和T24-Control细胞，用PBS制成细胞悬液，以200 μl含有100万个细胞的密度接种至裸鼠右侧腋窝皮下。待接种后的第10天开始测量裸鼠移植瘤的体积，以后每3天测量1次，直至第34天将裸鼠处死，取出瘤子并称重。瘤子体积的计算公式为V=ab2/2(a为瘤子的长径，b为瘤子短径)单位mm3。

1.2.6ELISA实验 用RIPA裂解样品，裂解液(10 μl)或将标准样品(10 μl)与稀释缓冲液(40 μl)预混合，放在37℃下孵育30 min，用缓冲液洗涤96孔板，添加链霉抗生物素蛋白-HRP。将96孔板放在37℃恒温箱中静置30 min，然后用缓冲液洗涤3次。加入100 μl四甲基联苯胺(TMB)底物溶液观察，96孔板避光放置37℃孵育10 min，每孔加入50 μl终止液停止反应。放置酶标仪上在450 nm处检测吸光度值，根据标准曲线计算出27-HC的水平。

2 结果

2.1 膀胱癌细胞中CYP27A1的mRNA水平T24细胞中AR表达水平较高，而CYP27A1的表达水平低，5637细胞中AR表达水平较低，而CYP27A1的表达水平高。AR在膀胱癌的发生和进展中起关键作用，所以选用T24细胞进一步研究CYP27A1与膀胱癌的关系，见图1。

图1 膀胱癌细胞中CYP27A1的mRNA水平

2.2 CYP27A1抑制膀胱癌细胞增殖将pLenti pLVX-IRES-Puro和pLenti CYP27A1-pLVX-IRES-Puro转染至T24细胞后，从mRNA水平(A)和蛋白质水平(B)检测，T24细胞稳定表达CYP27A1。CYP27A1高表达的细胞与对照细胞相比，明显抑制了细胞的增殖(C)。裸鼠移植瘤模型中，CYP27A1高表达组瘤子的体积(E)及重量(F)明显小于对照组，见图2。

图2 CYP27A1抑制膀胱癌细胞增殖

2.3 CYP27A1促进细胞分泌27-HC并抑制膀胱癌细胞增殖ELISA实验检测到CYP27A1高表达细胞分泌27-HC的量明显高于对照组(A)，MTT实验检测27-HC可抑制膀胱癌细胞的增殖(B)，见图3。

3 讨论

CYP27A1是一种细胞色素P450氧化酶，主要作用是调节体内胆固醇平衡和维生素D3代谢[12-13]。AR是配体调节的转录因子，在膀胱癌发生发展中起重要作用[3-4]。有研究显示，在不同分级的膀胱癌临床标本中AR表达之间没有差异[14]，但也有一些独立研究表明，雄激素-AR信号可以增加膀胱癌细胞的增殖[4]。此外，膀胱癌细胞中AR敲低后可导致细胞凋亡[15]，AR与膀胱癌有一定的相关性。因此，选用AR阳性膀胱癌细胞系研究CYP27A1与膀胱癌之间的关系具有可行性。

CYP27A1可将胆固醇转化为27-HC，分泌到细胞外进而影响细胞增殖[8]。但在前列腺癌和乳腺癌中，27-HC对细胞增殖的影响是不同的[8]。在乳腺癌中，27-HC可以增加ER(+)乳腺细胞增殖[9-10]。然而，在前列腺癌中，27-HC对细胞增殖的影响是有争议的[5,11]。我们主要选用AR阳性的膀胱癌细胞研究CYP27A1对膀胱癌细胞增殖的影响，并对其作用机制做进一步研究。本文选用AR高表达，CYP27A1低表达的膀胱癌细胞T24研究CYP27A1对胱癌细胞增殖的影响，首先采用转染的技术使T24细胞稳定表达CYP27A1，并在mRNA水平和蛋白质水平做了检测，确保CYP27A1的高表达。通过MTT实验发现，CYP27A1高表达的T24细胞的增殖能力与对照组相比明显减弱，在裸鼠移植瘤模型中，CYP27A1高表达组瘤子的体积及重量均小于对照组，体内和体外实验均表明CYP27A1可抑制膀胱癌细胞的增殖。CYP27A1可将胆固醇转化为27-HC，经ELISA实验检测到，CYP27A1高表达组中27-HC分泌量明显高于对照组。采用外源性的27-HC作用于T24细胞，结果显示27-HC可明显抑制细胞增殖。因此可得CYP27A1通过分泌27-HC，进而抑制膀胱癌细胞增殖。