儿童中性粒细胞功能异常的临床特点研究

夏 敏,郑 月，许无恨，肖咏梅，张 泓

(上海市儿童医院/上海交通大学附属儿童医院 1.检验科；2.消化科,上海200040)

慢性肉芽肿(chronic granulomatous disease;CGD)是以皮肤、肺及淋巴结广泛肉芽肿型损害为特点的遗传性粒细胞杀菌功能缺陷病。由于CGD患儿存在着NADPH氧化酶的某些成分缺失或减少，不能有效地产生具有杀菌活性的超氧阴离子及其代谢产物，从而吞噬细胞无法产生“呼吸爆发”，即中性粒细胞功能异常。一种通过流式细胞仪检测二氢罗丹明123转变成罗丹明123的诊断方法则被认为是一种客观、敏感、快速诊断CGD的方法[1]，且逐渐引关注。CGD的临床表现非常复杂，本研究拟通过流式法测定中性粒细胞功能，以分析异常儿童的发病特点和临床表现，完善相关基因检测，进一步明确诊断，避免漏诊。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2014年10月-2019年12月通过流式细胞法检测显示中性粒细胞功能异常患儿共41例，其中男28例，女13例，年龄23天-13岁，中位年龄3岁，住院35例，门诊6例；住院科室依次为呼吸科13例、肾脏免疫科6例、消化科8例、PICU 4例、新生儿科3例、血液科1例；门诊共6例：其中免疫门诊4例，儿内科门诊2例。健康成人和儿童的中性粒细胞可以被PMA激活，活化细胞均>90%，因此，在衡量中性粒细胞活化功能时一般以PMA刺激后活化细胞>90%为正常，流式法中性粒细胞功能异常判定标准为PMA刺激后活化率<90%或刺激指数<100[2]。

1.2 流式法测定中性粒细胞功能

1.2.1试剂与仪器

二氢若丹明(dihydrorhodamine，DHR)(Invitrogen，美国)，工作液浓度1∶100；佛波脂(phorbol myristate acetate，PMA)(Sigma，美国)，工作液浓度1∶3 000；流式细胞仪(FACS calibur，BD,美国)。

1.2.2样本处理

每次检测均使用一个正常儿童标本同时进行。抽取1-2 ml肝素抗凝血，混匀，室温，24 h内检测。分别标记二管为PBS对照管和PMA刺激管，每管中加全血50 μl在管底，不要碰到管壁。对照管中加入50 μl PBS，刺激管中加入50 μl PMA，混匀，37℃水浴箱中孵育15 min。加DHR123 25 μl，混匀，37℃水浴箱中孵育5 min(避光)。每管加1 ml溶血素，室温避光10 min，2 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入4 ml PBS洗涤1次，2 000 r/min离心5 min，弃上清，加500 μl PBS。

1.2.3数据分析

样本上流式细胞仪，应用CELLquest软件进行数据分析。先用PBS对照管进行设置，用前向角和侧向角调整至粒细胞可以清晰地显现(图1A)。中性粒细胞设门，并在以FL1(荧光1)为横坐标的直方图上调整电压将阴性对照控制在101之内，收集所有的对照管和刺激管的数据，每管样本收集10 000个细胞。分析时，用前向角比侧向角在门内将粒细胞挑选出并在特定区域内显示，若丹明荧光柱状图在门内获得，记录PBS浓度百分比、PMA刺激后百分比和刺激指数。

1.3 统计学分析

所有数据分析使用SPSS 16.0统计软件。两组样本均数比较采用两独立样本的t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特点

回顾性分析的中性粒细胞异常患儿共41例，其中男28例，PMA值为61.79±26.5，女13例，PMA值为66.39±17.7，男女比例为2.2∶1。年龄大于3岁多见，<3岁组和≥3岁组PMA值分别为58.2±22.5和66.2±25.2，可见性别和年龄均无统计学差异(表1)；41例中仅6例送检基因检测，阳性者4例，分别是ARMC4、NCF2、PRTNB和CYBB(见表1)。

表1 41例中性粒细胞功能异常患儿一般资料

中性粒细胞异常者多与慢性肉芽肿高度相关，但本研究中临床症状各异，多表现为反复肺部感染、各组织脓肿、脓毒血症和关节炎等，因患儿分散在各科室，不易引起重视，很多未能送检基因检测而错失进一步诊断明确的机会，漏诊率高(表2)。

表2 41例中性粒细胞功能异常患儿临床特点

2.2 流式图特点

文献报道，健康成人和儿童的中性粒细胞可以被PMA激活，活化细胞均>90%，因此，在衡量中性粒细胞活化功能时一般以PMA刺激后活化细胞>90%为正常。图1中A为FSC/SSC散点图，以中性粒细胞设门，图1B为正常人经PMA刺激后其DHR峰值右移，活化>90%，图1C为一CGD患儿经PMA刺激后直方图上DHR峰值几乎未有变化。

图1 FSC/SSC散点图、正常人、CGD患儿流式图(A、B、C)

2.3 慢性肉芽肿家族流式图

以下是一个CGD家族的患儿、患儿母亲及患儿父亲同时应用流式检测DHR的分析图。该家系中，图2为CGD患儿，DHR试验结果显示几乎无活性；图3为母亲呈现双峰表现，考虑为携带者，此为X-link的CGD表现；图4为患儿父亲，PMA刺激后DHR显示活性>90%，为正常，具体PMA和刺激指数见表3。

图2 CGD家族流式图(患儿)

图3 CGD家族流式图(患儿母亲)

图4 CGD家族流式图(患儿父亲)

表3 CGD家族PMA活性和刺激指数

3 讨论

中性粒细胞是人体防御的重要组成部分，参与机体的非特异性抗感染过程。中性粒细胞在被激活过程中，其NADPH氧化酶也被活化，发生“呼吸爆发”(respiratory burst),即指中性粒细胞在受刺激活化时，短时间内产生大量超氧离子等过氧化物，发挥杀菌作用。因此，中性粒细胞氧化和吞噬功能的测定可对临床诊断提供帮助，特别是在由于各类酶缺陷而造成中性粒细胞杀菌活性障碍的慢性肉芽肿疾病的诊断上。慢性肉芽肿病(CGD)是一种罕见的遗传性免疫缺陷，发病率为1/20万人[3]，与反复细菌感染，肉芽肿和死亡率增加有关。CGD分为x连锁的隐性遗传或常染色体隐性遗传两种，XL-CGD在中国占大多数病例，对某些感染的敏感性高于AR-CGD[4]。研究发现由gp91-phox基因突变引起的称为XL-CGD，而由p22-phox、p47-phox和p67-phox基因突变引起的称为AR-CGD[5]。

CGD患儿存在着NADPH氧化酶的某些成分缺失或减少，不能有效地产生具有杀菌活性的超氧阴离子及其代谢产物，如过氧化氢、氢氧根离子和次氯酸等，从而吞噬细胞无法产生“呼吸爆发”。因此它的特征是吞噬细胞(嗜中性粒细胞，单核细胞等)无法产生活性氧(ROS)，ROS是吞噬细胞杀微生物的主要组成部分[6]。无荧光的染料DHR123在中性粒细胞受 PMA刺激产生的大量超氧离子作用下被还原为具有荧光的罗丹明，通过流式细胞仪可直接检测受PMA刺激后中性粒细胞的荧光强度[7]。DHR分析可帮助快速诊断CGD[8]，但非典型结果应与临床表现，遗传分析和定期随访相结合，一些CGD患者的非典型临床表现可能会使DHR活性数据的基因型与表型相关性具有挑战性。遗传测试虽然对确认诊断有用，但可能需要数周的时间，在某些患者中无法提供结论性的答案。

CGD特点是皮肤、肺和淋巴结反复发生感染，肝脓肿及骨髓炎也较常见，胃壁局限性肉芽肿可致胃窦狭窄。此外，尚可引起视网膜损害、慢性腹泻、肛周脓肿和脑脓肿等。患儿一般发育延迟。结合本研究中回顾性地分析了中性粒细胞功能异常的患儿，发现绝大部分患儿临床均表现为反复肺炎、脓肿、反复和严重的脓毒血症等，但因为患儿散落在各科室，绝大部分患儿未能施行进一步的基因检测，从而延误了诊断，一方面源于部分临床医师对于CGD认识不足，一方面患儿分散而不集中缺乏统一管理，遗憾未能基因明确诊断，甚至使得部分患儿错失了造血干细胞移植等治疗的机会，本研究结果反映了现在真实的状况，提醒一定要及时沟通，特别对中性粒细胞功能异常的患儿，争取进一步进行慢性肉芽肿的基因检测以明确诊断。

另有研究表明，根据临床表现和NADPH氧化酶的功能可CGD可分成3种亚型[9]，正是由于3种亚型的存在，使得CGD的临床表现非常复杂，严重的幼年即发病，而症状较轻者直至青少年或成年后才发病并确诊。事实上，这些分类都是相对而言，不能将基因型与吞噬细胞的表型或临床表现完全一致的联系起来。正是因为中性粒细胞功能异常复杂多变的临床表现，更应增强儿科医师对CGD疾病的认识，继续完善基因检查，避免漏诊误诊，延误治疗。

总之，中性粒细胞功能异常患儿分布于各科室，临床几乎均出现反复、严重感染、预后差等特点，与慢性肉芽肿病高度相关，易漏诊，需基因检测进一步明确诊断。