多重耐药鲍曼不动杆菌相关耐药基因的研究

姜梅杰,朱 刚,王 薇,陈 霞,赵书平*

(1.泰安市中心医院 检验科，山东 泰安271000；2.泰安市泰山区人民医院 外科，山东 泰安271000；3.泰安市中心医院 ICU，山东 泰安271000；4.泰安市中心医院 急诊科,山东 泰安271000)

近年来多重耐药鲍曼不动杆菌的迅速增加，已给院内耐药菌感染控制及治疗带来巨大的挑战。医院多重耐药菌分析发现，多重耐药鲍曼不动杆菌(MDRAB)分离数位居第1位，与有关报道一致[1]。由于鲍曼不动杆菌适应性较强，定植率高，给院内感染控制带来极大挑战。为了治疗和控制MDRAB在院内的感染和传播，了解MDRAB耐药机制，对泰安市中心医院2019年2月至2019年10月间院内分离的15株MDRAB进行研究，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源筛选出的15株MDRAB，来自2019年2月至2019年10月该院各临床科室检测到的非重复标本。12株来源于痰标本、1株血液标本、1株胸腔穿刺液标本、1株尿液标本。其中ICU重症监护病房7株、呼吸重症监护病房3株、神经内科重症监护病房2株、神经外科重症监护病房1株、肾内科病房1株、急诊科普通病房1株。

1.2 细菌鉴定及药物敏感性试验严格按照《全国临床检验操作规程》(4版)进行细菌鉴定的操作。采用西门子WalkAway 96 PLUS NUC61复合板进行菌种鉴定及药物敏感性试验，K-B法检测头孢吡肟、厄他培南及头孢哌酮/舒巴坦药物敏感性。药物敏感性试验判读严格执行最新版CLSI标准，其中头孢哌酮/舒巴坦药物敏感性试验执行CLSI中头孢哌酮的标准，替加环素药物敏感性试验执行FDA的标准。K-B法药敏纸片及M-H琼脂均为英国Oxoid产品。铜绿假单胞菌ATCC27853、大肠埃希菌ATCC25922作为质控菌株。

1.3 多位点序列分型(MLST)用PCR对鲍曼不动7个管家基因gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi和rpoD进行序列扩增并测序。根据MLST数据库确定等位基因型及ST型(http://pubmlst.org/abaumannii)。再用eBURST(version 3;http://eburst.net)进行菌株亲缘性分析，将STs归类为克隆复合体(CC)，其中7个位点中有6个及6个以上位点相同定义为遗传相关克隆[2-3]。

1.4 耐药基因检测采用煮沸法提取细菌DNA模板，多聚酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法，对β-内酰胺类耐药基因、喹诺酮类耐药基因、消毒剂耐药基因qacE△及氨基糖苷类等相关耐药基因进行检测，引物参照文献[4-7]。NDM基因扩增引物序列参照中国疾病预防控制中心传染病预防控制所公布引物序列。

1.5 DNA测序部分阳性基因PCR产物由青岛睿博兴科生物技术有限公司进行测序，并将测序结果在GenBank网上查询。

2 结果

2.1 抗菌药物敏感试验结果15株MDRAB对头孢吡肟、头孢他啶、头孢曲松、哌拉西林/他唑巴坦、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林、环丙沙星、庆大霉素、亚胺培南、美罗培南均100%耐药，14株对阿米卡星和妥布霉素耐药，1株对阿米卡星和妥布霉素敏感；14株对替加环素敏感，1株中介。11株对头孢哌酮/舒巴坦耐药,4株对头孢哌酮/舒巴坦中介；9株对左氧氟沙星耐药，5株对左氧氟沙星敏感、1株对左氧氟沙星中介。

2.2 MLST分子分型结果15株MDRAB的MLST分子分型，共有5个序列类型，其中7株(46.7%)ST195型、3株(20%)ST369型、2株(13.3%)ST208型、2株(13.3%)ST368型、1株(6.7%)ST540型。均属于克隆复合体CC92[8]。

2.3 β-内酰胺类耐药基因及测序结果15株MDRAB100%携带blaOXA23基因(见图1)、blaOXA-51基因(见图2)及blaOXA64gp基因(见图3)，9株(60%)TEM基因PCR扩增阳性(见图4)，未检测出B类β内酰胺酶基因。随机取不同ST的blaOXA51、blaOXA-23、blaOXA64gp和TEM阳性基因PCR扩增产物进行测序，结果分别为blaOXA-51、blaOXA-23、blaOXA-66(见图5)型碳青霉烯酶基因和TEM-1广谱β-内酰胺酶。

图1 OXA23基因PCR扩增结果

图2 OXA51基因PCR产物扩增结果

图3 OXA64基因PCR产物扩增结果

图4 TEM-1基因PCR产物扩增结果

图5 OXA66基因PCR产物测序图

2.4 喹诺酮类、氨基糖苷类及消毒剂qacE△1耐药基因及测序结果15株MDRAB中，15株(100%)ant(3″)-Ⅰ基因阳性(见图6)，13株(86.7%)armA基因阳性(见图7)，4株(26.7%)aac(3)-Ⅰ基因阳性(见图8)，6株(40%)aac(6′)-Ⅰ基因阳性(见图9)，15株100%携带qacE△1基因(见图10)。未检出质粒介导喹诺酮类耐药基因。随机抽取ant(3″)-Ⅰ、aac(3)-Ⅰ、aac(6′)-Ⅰ及armA阳性基因PCR扩增产物进行测序，结果分别为16SrRNA甲基化酶基因armA、氨基糖甙类修饰酶基因ant(3″)-Ⅰ、aac(3)-Ⅰ和aac(6′)-Ⅰ。

图6 ant(3″)-Ⅰ基因PCR扩增结果

图7 armA基因PCR扩增结果

图8 aac(3)-Ⅰ基因PCR扩增结果

图9 aac(6′)-Ⅰ基因PCR扩增结果

图10 qacE△1基因PCR扩增结果

3 讨论

MDRAB是院内感染的重要病原菌之一。2019年本院临床分离非重复鲍曼不动杆菌581株，碳青霉烯药物亚胺培南耐药率大于58%，本院院内分离的鲍曼不动杆菌自2012年以来，对亚胺培南耐药率一直很高，但低于有关报道[9]。本研究15例MDRAB菌株，12株(80%)分离于痰标本，13株(86.7%)分布于各重症监护病房，说明本院MDRAB主要来源于各重症监护病房、使用机械通气患者的上呼吸道标本痰液，主要引起呼吸道感染。这与有关报道一致[10]。鲍曼不动杆菌环境适应性很强，易定植在呼吸机的管道上，可在吸痰时被冲入痰液，因此培养阳性后需根据症状、实验学和影像学等结果排除定植以明确感染。有研究显示重症监护室中鲍曼不动杆菌的感染暴发与其环境传播密切相关[11]。

运用多位点基因测序MLST法对15株MDRAB进行亲缘性分析，结果有5个序列类型，其中7株(46.7%)ST195型、3株(20%)ST369型、2株(13.3%)ST208型、2株(13.3%)ST368型、1株(6.7%)ST540型，均属于克隆复合体CC92[8]，且发现在不同时间段ICU重症病房和其它科室重症病房都出现过ST195型和ST369型MDRAB流行株，说明ST195型和ST369型MDRAB一定时段内在院内存在播散流行，这可能和病人的转入转出有关。提示医院感控部门应加强重症监护病房转入转出多重耐药菌患者的管理，预防院内感染爆发。

15株MDRAB氨基糖苷类修饰酶ant(3″)-Ⅰ、aac(6′)-Ⅰ和aac(3)-Ⅰ的携带率分别为100%(15/15)、40%(6/15)和26.7%(4/15)，未检出其他氨基糖苷类修饰酶；16S rRNA甲基化酶基因armA的携带率为86.7%(13/15)。对庆大霉素100%耐药，其中13株携带16S rRNA甲基化酶基因armA的MDRAB对阿米卡星、庆大霉素和妥布霉素100%耐药。本院鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类抗菌药物耐药与氨基糖苷类耐药基因密切相关。对环丙沙星100%耐药，9株对左氧氟沙星耐药，耐药率为60%，但未检出质粒介导的喹诺酮类耐药基因，说明本院MDRAB对喹诺酮类耐药与质粒介导的喹诺酮类耐药基因无关，需要进一步加强对其它耐药机制的监测和研究。左氧氟沙星耐药率为60%，和其它临床常用药物相比耐药率相对偏低，可作为MDRAB耐药菌感染治疗的联合用药。15株MDRAB 100%携带消毒剂耐药基因qacE△1。对消毒剂的高耐药率也可能是MDRAB在本院内流行的重要原因之一。

15株MDRAB中均携带blaOXA-51、blaOXA23、blaOXA64gp基因，9株(60%)携带TEM-1基因。对β-内酰胺及加酶抑制剂药物头孢吡肟、头孢他啶、头孢曲松、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、氨苄西林/舒巴坦、亚胺培南、美罗培南均表现出100%的高耐药率，未出现对替加环素耐药菌株。TEM为超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum β-lactamases,ESBLs)，主要水解氧亚胺基头孢菌素以及氨曲南等单环β-内酰胺类抗生素[12]，可被β-内酰胺酶抑制剂所抑制。Krizova等[13]发现TEM-1型酶基因表达水平与舒巴坦最小抑菌浓度(minimuminhibitory concentration,MIC)成正相关。鲍曼不动杆菌对碳青霉稀类抗生素的耐药机制主要为产生碳青霉烯酶，blaOXA-51为鲍曼不动杆菌染色体上固有基因，其它均为获得性碳青霉稀酶基因[14]。本研究显示，除固有基因blaOXA-51检出率为100%外，blaOXA-23和blaOXA64gp检出率也均为100%。blaOXA-23和OXA-51型变异体OXA-66型酶基因为本院阶段性MDRAB菌株携带的最主要的碳青霉烯酶，是导致耐药性传播的主要基因型。替加环素是一类新型的甘氨酰环类抗生素，体外药敏结果显示它对包括多重耐药菌在内的革兰阴性菌和革兰阳性菌均具有良好的抗菌活性，因此成为目前代替碳青霉烯类抗菌药物的“最后选择”[15],可作为本院MDRAB耐药菌感染治疗的首选药物。

鲍曼不动杆菌为条件致病菌，环境适应性强，具有较强获得耐药性和克隆传播的能力，培养阳性后应根据临床症状、影像学等其他检查结果综合分析判断其致病性。准确及时的分子流行病学监测，对于控制院内MDRAB感染暴发流行，及时准确查找传染源具有重要意义。