三七皂苷R1对血小板衍生生长因子BB诱导血管平滑肌细胞增殖的影响

蔡 婷，明平红

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)是动脉中膜的主要组成成分，其由中膜层迁移至内膜下层间隙并异常增殖或凋亡是动脉粥样硬化、高血压、血管狭窄等多种心血管疾病的共同发病基础[1]。三七是临床常用的传统中药，具有强壮补虚、消肿镇痛、活血化瘀等功效。研究表明，三七在预防和治疗心脑血管系统、中枢神经系统、抗氧化、抗自由基损伤等方面具有较好活性[2-5]。三七皂苷R1(notoginsenoside R1，NGR1)是三七提取物中有效活性成分之一，然而NGR1是否具有预防和治疗动脉粥样硬化作用并不清楚。本研究拟采用血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)诱导VSMC增殖，再加入NGR1进行干预，研究NGR1对增殖型VSMC的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 NGR1由上海源叶生物科技有限公司生产，货号：B21099，CAS号：80418-24-2，配制成1 mg/mL作为母液浓度储存备用。细胞计数试剂盒(CCK-8)购自大连美仑生物技术有限公司，货号：MA0218。VSMC由华中科技大学附属同济医院提供。胰蛋白酶(trypsin)、胎牛血清(FBS)、PDGF-BB购自Gibco公司。

1.2 主要仪器 二氧化碳(CO2)培养箱(品牌：Thermo Scientific，型号：BB150)；多功能酶标仪(品牌：BioTek，型号：Epoch2)；荧光倒置显微镜(品牌：OLYMPUS，型号：BX51-P)

1.3 细胞培养 VSMC在DMEM完全培养基(含10%FBS、1%青霉素和链霉素)中静置于37 ℃的CO2培养箱中进行培养。当细胞生长融合约至90%后，用胰蛋白酶消化传代，取3～5次传代对数生长期细胞进行实验。

1.4 CCK-8检测细胞增殖实验 收集对数生长期的VSMC，用胰蛋白酶消化，调节细胞悬液浓度为1×105/mL，接种100 μL细胞悬液到96孔板中，置37 ℃、5%的CO2培养箱中培养。设置空白组(A组)、PDGF-BB诱导组(B组)、PDGF-BB+20 μmol/L NGR1组(C组)、PDGF-BB+40 μmol/L NGR1组(D组)、PDGF-BB+80 μmol/L NGR1组(E组)、PDGF-BB+160 μmol/L NGR1组(F组)。待细胞贴壁融合约50%后，在20 ng/mL的PDGF-BB刺激下[6]加入不同剂量的NGR1(20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、160 μmol/L)继续处理24 h和48 h，再向每孔加入10 μL的CCK-8继续培养1 h，加入10 μL的HCL终止，在酶标仪上(450 nm)测各孔的OD值，每组设6个复孔。

1.5 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染细胞核实验 取对数期生长的VSMC细胞，接种于6孔板，设置空白组(A组)、PDGF-BB诱导组(B组)、PDGF-BB+20 μmol/L NGR1组(C组)、PDGF-BB+40 μmol/L NGR1组(D组)、PDGF-BB+80 μmol/L NGR1组(E组)、PDGF-BB+160 μmol/L NGR1组(F组)。先用PDGF-BB诱导VSMC增殖，再使用不同浓度NGR1(20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、160 μmol/L)处理48 h，移除培养基，1×磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞，4%多聚甲醛固定细胞15 min，移除多聚甲醛并洗涤，用1% Triton-X-100破膜10 min，1×PBS漂洗之后，用100 mg/L DAPI染色10 min，PBS漂洗之后，于荧光显微镜下观察细胞核形态变化。

2 结 果

2.1 NGR1对增殖型VSMC增殖的影响 B组细胞增殖率明显高于A组(P<0.05)，说明PDGF-BB可诱导VSMC增殖；C组细胞增殖率与B组比较差异无统计学意义(P>0.05)，但D组细胞增殖率明显高于B组(P<0.05)，说明NGR1浓度增加至40 μmol/L时，NGR1可促进VSMC增殖；E组(80 μmol/L)和F组(160 μmol/L)细胞增殖率均明显低于B组(P<0.05)，随着浓度增大和时间延长，细胞增殖率降低。说明较低浓度的(40 μmol/L)NGR1能够促进VSMC增殖，而较高浓度的(80 μmol/L和160 μmol/L)NGR1能够抑制VSMC的增殖，且呈时间和剂量依赖性。详见表1、图1。

表1 NGR1对增殖型VSMC增殖的影响 (±s) 单位：%

图1 NGR1对增殖型VSMC增殖的影响

2.2 NGR1对增殖型VSMC凋亡的影响 DAPI染色结果显示，NGR1在低浓度(20 μmol/L和40 μmol/L)时细胞核形态未发生明显改变，但随着NGR1浓度增加至高浓度(80 μmol/L和160 μmol/L)，细胞核形态呈圆形且出现大小不一的高致密片段，甚至出现凋亡小体(160 μmol/L)，说明高浓度NGR1能诱导PDGF-BB诱导的增殖型VSMC凋亡且呈剂量依赖性。详见图2。

图2 NGR1诱导增殖型VSMC凋亡情况

3 讨 论

VSMC是动脉中膜的主要组成成分，参与了动脉粥样硬化斑块形成的所有阶段[1，7]。根据损伤反应和易损斑块假说，收缩型VSMC在炎性因子的刺激下经过表型活化转化为增殖型细胞，然后从中膜层向内膜层大量迁移与增殖，并摄取脂质成为肌源性泡沫细胞，当脂质过分充满细胞时，导致细胞发生凋亡。未清除的凋亡细胞随后发生继发性坏死，进一步释放炎性物质，在PDGF以及转换生长因子-β(TGF-β)等刺激下，胶原纤维和弹力纤维组成纤维帽包绕脂池形成典型的粥样硬化斑块，最终使血管内膜增厚，导致管腔狭窄[8]。因此，有效抑制血管损伤后血管平滑肌细胞的过度增殖和迁移，可能成为抗血管再狭窄和抗动脉粥样硬化形成的治疗策略。

NGR1是三七总皂苷中有效活性成分之一，三七总皂苷对增殖型VSMC具有抑制作用[9-11]，为了研究NGR1对增殖型VSMC的影响，本研究用PDGF-BB诱导VSMC转化成增殖型细胞，与空白组比较，细胞数量明显增加，证实PDGF-BB能成功诱导VSMC增殖[12-13]。成功诱导后再加入不同剂量的NGR1处理24 h和48 h，发现NGR1在低浓度(40 μmol/L)时可促进VSMC增殖，但在高浓度(80 μmol/L和160 μmol/L)时能抑制VSMC增殖，且呈剂量依赖性。研究表明，大多数药物一般通过诱导细胞凋亡来抑制细胞增殖[14-17]。本研究显示，NGR1在低浓度(20 μmol/L和40 μmol/L)处理增殖型VSMC 48 h后，细胞核形态并未发生明显改变，但随着NGR1浓度增加至高浓度时(80 μmol/L和160 μmol/L)，细胞核逐渐变成圆形且出现大小不一的高致密片段(80 μmol/L)，当NGR1浓度达160 μmol/L时出现典型的凋亡小体，说明高浓度NGR1能诱导增殖型VSMC发生凋亡。

PDGF-BB可诱导VSMC转化成增殖型细胞。低浓度的NGR1可促进VSMC增殖，高浓度的NGR1能抑制VSMC增殖，且呈剂量依赖性，并能进一步诱导VSMC发生凋亡。因此，本研究提示合理浓度范围的NGR1可能对预防和治疗动脉粥样硬化类疾病具有重要作用。