鸡饲料及原料中玉米赤霉烯酮污染的检测及分布研究
2021-06-23陈继美
陈继美,陈 奋
(1.广西贵港市桂平市石龙镇水产畜牧兽医站,广西 桂平 537200;2.桂平市金田镇水产畜牧兽医站,广西 桂平 537200)
0 引言
玉米赤霉烯酮(ZEN)是一种真菌毒素,会在适应的环境条件下产生,它又被称为F-2毒素,可以由多种菌种转变而成,常见的菌种有尖孢镰刀菌、三线镰刀菌、粉红镰刀菌、禾谷镰刀菌等,具有与雌激素相似的作用,可以造成生殖毒性和致畸。通过检测鸡饲料及原料是否含有玉米赤霉烯酮的方式来监控饲料的污染情况。
1 检测材料及方法
1.1 材料与试剂制作
本次研究使用免疫亲和柱、色谱纯、甲醇、乙腈等材料,亲和柱选用的是helix玉米赤霉烯酮免疫亲和柱,并选用10 mg的玉米赤霉烯酮进行实验。在分析提出方面采用广州市广联津化工有限公司的去离子水、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾等物品。
试剂制作的步骤:明确试剂提取标准,试剂提取标准为乙腈与水的比例为9:1。制作磷酸盐缓冲液,制作标准为pH 7.4(50 mm PBS),需要使用磷酸氢二钾7.27 g、磷酸二氢钾1.24 g、氯化钠8.76 g进行溶解,离子水的含量为1L。
1.2 仪器与设备
设备仪器采用的是美国Agilent公司出品的荧光检测器和Agilent1260高效液相色谱仪。同时使用空气压力泵、超声振荡仪、SPE固相萃取装置、涡旋混合器、离心机等设备仪器[3]。
1.3 检测方法
1.3.1 配制标准溶液
标准溶液配制需要采用玉米赤霉烯酮标准物和甲醇2种材料,然后准确称取适量的玉米赤霉烯酮标准物并与甲醇进行溶解,配制的标准储备溶液浓度保持在100.0 μg/mL(参考资料数据),再用超纯水分别配成5份浓度不同的工作溶液,浓度分别是10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、200 μg/L、500 μg/L,等待测量。
1.3.2 制备与提取试样
精准称取20 g样品,将其进行粉碎,放入100 mL的离心管中,在离心管中加入50 mL提取液,通过涡旋混合器搅拌均匀,搅拌时间为1 min,将搅拌好的试剂放入超声波清洗器内30 min,在过程中对试剂震荡2~3次,每次速度为10 000 r/min离心,持续时间5 min,然后倒入试管进行备用。接着取出其1 mL,在清液中加入9 mL磷酸盐缓冲液,搅拌均匀。
1.3.3 样品净化
将免疫亲和柱放置在玻璃注射器下,然后取出10 mL的试样放入玻璃注射器中。通过调节压力方式让试样慢慢经过玻璃注射器,使清液流入免疫亲和柱中,注意控制清液流速在1滴/s。待清液完全进入亲和柱后,再用20 mL去离子水淋洗免疫亲和柱,速度为1~2滴/s,当液体全部进入亲和柱后抽干玻璃注射器的液体和空气。
1.3.4 洗脱
洗脱需要在免疫亲和柱中进行。具体方式:先加入0.5 mL甲醇,待30 s后,再加入0.5 mL,然后收集洗脱液,并使用0.22~0.45μm有机滤膜进行过滤,并将过滤得出的液体放入机器。
1.3.5 高效液相色谱条件
色谱柱需要保持柱温为30℃,采用的是C18柱色谱柱。流动相采用比例为75:25的甲醇水,保持流速为1.0 mL/min。检测波长的条件是发射波长440 nm,激发波长274 nm。
1.3.6 测定样品
在提取出鸡饲料与原料中的样品后,使用液相色谱分析法分析样品的具体成分,将样品放入提取液中进行测量,进样量为100.0 μL。
2 结果与讨论
2.1 优化色谱条件
玉米赤霉烯酮可以发出荧光,且颜色为蓝绿色,可以通过荧光检测器进行检测。而且,根据相关研究发现,当激发波长为274 nm、射波长为440 nm时,最容易将米赤霉烯酮检测出来。本次实验采用的是C18柱反相色谱柱,使用甲醇‐水作为流动相,并且保持流速为1.0 mL/min。因此,根据实验条件可以得出玉米赤霉烯酮的色谱峰,保留时间长达7.5 min,实验条件能够满足检测需求。
2.2 鸡饲料中玉米赤霉烯酮的分布情况
在5种118批鸡饲料中检测,结果如表1所示。玉米赤霉烯酮在118批鸡饲料的检测结果为30.51%,超出标准量5.08%。大鸡料的检测结果为167.78 μg/kg,属检测结果最大值,蛋鸡料检测结果为28.18 μg/kg,属检测结果最小值。
表1 鸡饲料中玉米赤霉烯酮检测结果
3 结语
通过高效液相色谱-荧光检测方法可以快速检测出饲料及原料中玉米赤霉烯酮的含量,是一种高效的检测方法。