基于可溶性胶原的牙周缓释剂体外抑菌对照实验研究

马苑萍 张振庭 杨圣辉 程 倩 王 昊

牙周炎是最常见的口腔疾病之一，是成年人失牙的主要原因，是主要由牙菌斑引起的牙周支持组织的炎性破坏性、感染性疾病[1]。目前牙周炎治疗的主要方法是牙周基础治疗即龈上洁治术、龈下刮治术和根面平整(scaling and root planing，SRP)[2,3]。但是受牙齿解剖形态、牙周袋深度等原因的影响，治疗效果常受到限制，而且有些患者龈上菌斑控制不好，口腔卫生差，治疗效果也会受到影响，因此局部使用药物成为了牙周炎基础治疗重要的辅助手段之一[4,5]。与全身给药相比，牙周局部抗菌缓释剂具有用药剂量小，到达病变部位的药物浓度可保持在有效范围内，有效血药浓度维持时间长，血药浓度峰谷波动小等优点。口腔局部给药亦可避免首过效应，提高病人服药的顺应性，在牙周炎的临床治疗中展示了良好的治疗效果和应用前景。近年来，寻找具有良好的生物降解性和高度生物相容性，价格低廉，缓释效果较好的缓释材料成为牙周缓释剂的研究热点，目前牙周缓释材料主要有脂质体、水凝胶、壳聚糖、聚乳酸等[6,7]。本实验使用的缓释材料为可溶性胶原(Atelocollagen)。

可溶性胶原(Atelocollagen)是将胶原分子中免疫原性最强的成分-端肽用酶等物质处理后再合成，它具有特定的生物学性能，如免疫活性及抗原性低、生物相容性好、能被身体组织吸收、能促进细胞分化及组织再生修复等。胶原所具有的羧基和氨基经化学修饰后，可成为新的生物材料。牛皮来源的可溶性胶原很早就已经在国外作为整形美容材料用于人体了。去除了端肽后的牛皮胶原，虽然能引起人体的免疫反应，但是对人体是没有任何危害的[8]。因可溶性胶原良好的生物学性能，它已被广泛应用于医疗领域，如人工肾脏透析膜、人工心肺、人工角膜、人工血管、外科手术缝合线等[9]，尤其引人注目的是，可溶性胶原的细胞分化活性可以诱导成骨细胞的粘附及分化[10]，这对牙周组织的修复也有重要的意义。近年来，国外以胶原为缓释材料的牙周缓释制剂已被商品化(periodental plus AB)[11,12]，还有研究将胶原作为缓释材料与甲硝唑联合制备成牙周缓释剂，发现其有很好的临床效果[13]。目前，胶原缓释材料在国内还没有得到很好的应用，本文以牛皮胶原作为缓释材料，联合药物二甲胺四环素和环丙沙星，看其对牙周致病菌的抑菌作用，为下一阶段可溶性胶原缓释剂体内实验提供基础，为缓释剂的研制提供理论依据。

1.材料和方法

1.1 可溶性胶原缓释剂的制备

1.1.1 可溶性胶原缓释材料的制备 将牛皮胶原进行可溶性处理。取生牛皮网状层做原料，将其绞碎，用10%氯化钠抽取去除溶解性球蛋白，用乙醚抽取去除脂肪，再用pH8 磷酸缓冲液和pH3.5磷酸三羧酸反复抽取后，经酶蛋白水解，低温分离出可溶性胶原。将可溶性胶原配制成三种不同浓度(1%，2%和3.5%)的胶原原液。(缓释材料的制备由日本株式会社高研研究所完成)(图1)。

图1 可溶性胶原(atelocollagen)

1.1.2 可溶性胶原缓释剂制备与分组 将二甲胺四环素(Sunstar INC，日本)与可溶性胶原缓释材料混合，制备出可溶性胶原二甲胺四环素缓释剂，称为二甲胺四环素组。将环丙沙星(中国药品生物制品检定所)与可溶性胶原缓释材料混合，制备出胶原浓度为2%的可溶性胶原环丙沙星缓释剂，称为环丙沙星组。将环丙沙星组与二甲胺四环素组(胶原浓度也为2%)相比，比较两组牙周缓释剂对4 种牙周致病菌的抑菌能力差异。

二甲胺四环素组根据胶原浓度不同分为一、二、三组，胶原浓度分别为3.5%，2%和1%。对照组为盐酸米诺环素软膏(派丽奥)组(二甲胺四环素浓度20mg/ g，Sunstar INC，日本)，未添加胶原成分。二甲胺四环素组与派丽奥组相比，比较它们的抑菌能力差异。

1.2 配置药敏培养基 实验使用的4 种常见牙周炎致病菌，牙龈卟啉单胞菌(P.g)(ATCC 33277)、中间型普氏菌(P.i)(ATCC 25261)、具核梭杆菌(F.n)(ATCC 10953)、粘性放线菌(A.v)(ATCC 19246)(首都医科大学附属北京口腔医院研究所提供)。采用定量悬液法，将这4 种菌株活化、提纯和增菌，制作菌悬液，分别取0.1ml 均匀涂入CDC 厌氧血琼脂培养基。

1.3 实验步骤

1.3.1 五组牙周缓释剂最低抑菌浓度(MIC)检测 对四组可溶性胶原牙周缓释剂(二甲胺四环素三组和环丙沙星组)以及派丽奥软膏分别进行活性测定，测量这五组牙周缓释剂对4 种牙周炎致病菌的最低抑菌浓度(MIC)。将二甲胺四环素组和环丙沙星组用胶原原液依次做3 倍稀释，派丽奥软膏用生理盐水依次做3 倍稀释，使得五组药物浓度均由高到低分为10 个梯度(1-10)，分别是21.1mg/ mL，7.033mg/ mL，2.344mg/ mL，0.781mg/ mL，0.260mg/ mL，0.086mg/ mL，0.028mg/ mL，0.009mg/ mL，0.003mg/ mL，0.001mg/ mL。将药物与CDC 培养基混合后，铺平皿。每组药物从浓到稀铺10 个平皿，并设有两个空白对照，将稀释的菌液点种至药物平皿上，厌氧37℃，培养5d，观察MIC[14]。

1.3.2 牙周致病菌对五组牙周缓释剂的药敏实验 采用钢管法进行药敏实验，在药敏培养基上放上消毒过的钢管，向管内加注不同药物浓度的可溶性胶原缓释剂和派丽奥，厌氧37℃，培养5d，测量钢管周围缓释剂抵制细菌的生长直径并记录。每组重复5 次。

1.4 统计学处理 采用SPSSl3.0 软件对数据进行统计学分析，使用K-S 检验证实数据符合正态分布，Levene 检验证实数据方差齐，应用单因素方差分析对多组实验结果之间进行检验，运用T检验对两组实验结果之间进行检验。检验水准α=0.05。P﹤0.05 被认为有统计学差异。

2.结果

所有实验细菌均生长良好。表1 是五组药物对4 种常见菌的最低抑菌浓度，均小于0.009mg/ mL。环丙沙星组对4 种菌株的最低抑菌浓度小于0.009mg/ mL，二甲胺四环素组对4 种菌株的最低抑菌浓度小于0.003mg/ mL。表2 是二甲胺四环素组中的第二组与环丙沙星组(胶原浓度均为2%)在药物浓度为0.009mg/ mL、0.003mg/ mL 及0.001mg/ mL 时对4 种常见菌的抑菌环直径比较。药物浓度在0.009mg/ mL 时，二甲胺四环素组对4 种细菌均表现出比环丙沙星组更强的抑菌能力(P﹤0.05)；药物浓度在0.003mg/ mL 时，二甲胺四环素组对P.g 和F.n 菌株的抑菌能力比环丙沙星组更强，差异有统计学意义(P﹤0.05)；药物浓度在0.001mg/ mL 时，二甲胺四环素组对F.n 和A.v 菌株的抑菌效果比环丙沙星更好(P﹤0.05)。

表1 五组药物对4 种牙周致病菌的最低抑菌浓度(mg/ mL)

图2 为四组药物对P.g 菌株、P.i 菌株、F.n菌株、A.v 菌株的抑菌实验结果。对于P.g 菌株，当浓度较高时(﹥2.344mg/ mL)，派丽奥组和二甲胺四环素组的抑菌效果无明显差异，随着药物浓度的降低，二甲胺四环素组中的三组牙周缓释剂的抑菌能力普遍高于派丽奥组，尤其在药物浓度为0.781mg/ mL(F=96.60，P﹤0.05)和0.009mg/ mL(F=45.11，P﹤0.05)时，表现出比派丽奥明显更强的抑菌作用(图2a、图3)，差异有统计学意义；对于P.i 菌株，药物浓度为21.1mg/ mL(F=36.59，P﹤0.05)，7.033 mg/ mL(F=72.40，P﹤0.05)以及2.344mg/ mL(F=85.15，P﹤0.05)时，派丽奥组比胶原浓度为2%和1%的二甲胺四环素组具有更强的抑菌作用，药物浓度降低至0.086mg/ mL(F=39.87，P﹤0.05)，0.028mg/ mL(F=48.54，P﹤0.05)和0.009mg/ mL(F=20.38，P﹤0.05)时，派丽奥组的抑菌能力则明显低于二甲胺四环素组(图2b、图4)，差异有统计学意义；对于F.n 菌株，当药物浓度为0.009mg/ mL(F=67.24，P﹤0.05)，0.003mg/ mL(F=21.80，P﹤0.05)，0.001mg/ mL(F=32.12，P﹤0.05)时，二甲胺四环素组具有较强的抑菌作用(图2c、图5)；对于A.v 菌株，当药物浓度为0.009mg/ mL(F=15.48，P﹤0.05)和0.001mg/ mL(F=22.77，P﹤0.05)时，二甲胺四环素组比派丽奥组抑菌能力更强(图2d、图6)，差异具有统计学意义。

图2 四组药物对4 种常见菌的抑菌环直径测量结果趋势图

图3 四组药物对P.g 菌株抑菌环直径测量结果。

图4 四组药物对P.i 菌株抑菌环直径测量结果。

图5 四组药物对F.n 菌株抑菌环直径测量结果。

图6 四组药物对A.v 菌株抑菌环直径测量结果

3.讨论

牙周缓释剂是牙周基础治疗有效的辅助手段。牙周缓释剂中的缓释材料十分重要，缓释材料可避免药物突释，确保药物在一定浓度内缓慢稳定释放，还可增强药物的生物相容性和组织靶向性。胶原蛋白因其良好的生物相容性，低免疫原性，优良的止血性能成为了缓释材料的研究热点[15,16]，本实验使用的是牛皮胶原中提取的可溶性胶原。实验结果显示，环丙沙星组对中间型普氏菌和具核梭杆菌的MIC 高于二甲胺四环素组。环丙沙星组对4 种菌株的最低抑菌浓度小于0.009mg/ mL，而二甲胺四环素组对4 种菌株的最低抑菌浓度小于0.003mg/ mL，且在药物浓度较低时(﹤0.009 mg/ mL)，胶原浓度相同(2%)的环丙沙星组和二甲胺四环素组相比，二甲胺四环素组对4 种牙周致病菌的抑菌能力普遍要高于环丙沙星组，提示二甲胺四环素与可溶性胶原结合后的抑菌能力更强。有研究显示环丙沙星和二甲胺四环素都是比较好的牙周炎治疗药物[14]，但是本实验显示二甲胺四环素组的抑菌效能更高，与可溶性胶原结合后，表现出比环丙沙星组更强的抑菌作用，是牙周缓释剂比较好的药物选择。

在对P.g 菌株的抑菌实验中(图2a、图3)，发现当浓度较高时(﹥2.344mg/ mL)，派丽奥组和二甲胺四环素组的抑菌效果无明显差异，但是当药物浓度为小于0.781mg/ mL，浓度逐渐降低时，二甲胺四环素组却比派丽奥组有更强的抑菌作用，表明可溶性胶原缓释剂可以比较稳定地维持药物的疗效，避免药物的突释，促进药物地缓慢释放，这也提示可溶性胶原作为缓释材料的可行性。

在对P.i 菌株的抑菌实验中(图2b、图4)，可以看出当药物浓度处于较高的水平时(﹥2.344mg/ mL)，可溶性胶原浓度为3.5%的二甲胺四环素组比胶原浓度为1%和2%的二甲胺四环组的抑菌作用更强，提示胶原的浓度可能影响药物的抑菌作用，但是两者之间量效关系如何，还需要进一步的实验来验证。此外，在对P.i 菌株的抑菌实验中，高药物浓度时，派丽奥组出现了比胶原浓度为1%和2%的二甲胺四环组更强的抑菌作用，但是随着药物浓度的降低，派丽奥组的抑菌能力则逐渐低于二甲胺四环素组，这也进一步表明可溶性胶原缓释剂药效的稳定性。在对F.n 和A.v 菌株的抑菌实验中(图2c、图2d，图5、图6)在药物浓度较高时，二甲胺四环素组和派丽奥组均表现出了良好的抑菌作用，但是在药物浓度较低时(﹤0.009mg/ mL)，派丽奥组的抑菌作用则低于二甲胺四环素组。可溶性胶原牙周缓释剂在药物浓度较低时还能保持比较好的抑菌效能，在一定程度上说明了可溶性胶原较好的缓释作用，促使药物能比较稳定缓慢地释放，这在临床上是有很有意义的，但是受实验样本量的限制，未来我们还需要进一步的实验来验证这一观点。

可溶性胶原牙周缓释剂良好稳定的抑菌性能是其能运用于临床的基础条件之一。现在临床上广泛应用的派丽奥软膏的主要成分也是二甲胺四环素，添加物的主要成分是羟乙基纤维素，派丽奥抗菌作用强，局部浓度高，药物缓慢释放，在牙周袋内停留时间长，是非常好的牙周缓释剂，但是它是一种溶性油脂缓释剂，遇水变为较硬的高粘度凝胶状，不易从牙周袋流出，不能被组织吸收，这是需要改善的地方，而可溶性胶原可以在体内完全降解，可代谢吸收，这也是当前临床使用的派丽奥所不能达到的[17]。此外，可溶性胶原与宿主细胞之间有良好的相互作用，可促进不同类型细胞生长，它的成骨作用可以促进牙周组织的修复，这也是它对于其它缓释材料的优势[18]。本实验发现可溶性胶原牙周缓释剂对4 种口腔牙周常见致病菌均有良好的抑菌作用。在药物浓度降低时，其作用优于牙周缓释剂派丽奥，提示可溶性胶原作为牙周缓释材料的应用价值，但是从实验阶段过渡到临床应用，还需要做大量的工作和更深入的研究。