外泌体源性miRNAs在结直肠癌中的研究进展

龚 婷，王正根

结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是世界上三种最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有120万新发病例和50万死亡病例[1]。早期CRC患者的5年生存率接近90%，如果早期确诊有被治愈的可能，且早期诊断和早期治疗可以显著提高CRC患者的总生存率[2]。结肠镜检查有较高的诊断率，但因检查不便且具有侵入性，可能引起相关并发症而将其限制在二级预防中。目前的筛查方法，如粪便隐血实验（fecal occultblood test,FOBT）、粪便免疫化学试验都有各种局限性，只有30%-40%的患者在早期被发现[3]。癌胚抗原（carcino embryonic antigen,CEA）是一种传统的血清生物标志物，用于监测CRC复发，但由于其低灵敏度和特异性，并不是合适的诊断性生物标志物。外科手术、放化疗及靶向治疗在结直肠癌的治疗方面均有一定进展，但治疗效果欠佳。因此，发现具有高灵敏度和特异性的血清生物标志物以促进CRC的早期诊断、治疗及预后评估是有必要的。外泌体miRNAs是肿瘤细胞微环境中信号交流的重要媒介，几乎参与肿瘤发生发展的整个生物学过程。本文就外泌体miRNAs在CRC中的发生发展、诊断、治疗及预后评估等方面进行综述。

1 外泌体简介

1.1 外泌体的生物学特征 外泌体是由正常或癌变细胞的细胞膜衍生的囊泡，大小在30 nm-100 nm[4]、40 nm-100 nm[5]、50 nm-150 nm[6]不等，释放入如功能性细胞外液（血液、淋巴液及组织液等）、胆汁、母乳、尿液和唾液等各种体液中[7]。外泌体中富含多种生物活性物质，包括核酸（如miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA、tRNA）、蛋白（如融合蛋白、膜转运蛋白、热休克蛋白）、脂质（如胆固醇、磷脂）等，其成分不同取决于源细胞的功能状态[8]。有多种机制参与外泌体的释放过程，其中最主要的机制是多囊体与细胞膜融合。释放的外泌体可通过直接融合、受体-配体融合或受体介导的内吞作用等方式被受体细胞吸收[9]。大部分进入靶细胞内的外泌体将被溶酶体所降解以供细胞代谢所需，仅有小部分的外泌体释放出内容物，并以此介导细胞间的通讯。外泌体介导的细胞间通讯主要有以下三种方式：①外泌体膜蛋白与靶细胞膜蛋白相结合，激活靶细胞信号通路；②在细胞外基质中，蛋白酶切割外泌体膜蛋白，然后与细胞膜上的受体结合以激活细胞膜细胞内的信号通路；③外泌体膜可直接与靶细胞膜融合，刺激外泌体源性蛋白质、mRNA和microRNA的非选择性释放[10,11]。有研究[12-14]表明，转移前生态位的形成依赖于肿瘤来源的外泌体。外泌体的功能取决于它们来源的细胞类型[15,16]，不同细胞类型来源的外泌体具有不同的功能。肿瘤来源的外泌体参与肿瘤细胞和基质细胞之间的遗传信息交流，导致大量新生血管形成，促进了肿瘤的生长和侵袭[17,18]。

1.2 外泌体miRNAs微小RNAs（miRNAs）是一类长度为18-22个核苷酸单链的非编码RNA，转录后调节基因表达及控制各种细胞机制，包括各种肿瘤发生和发展[19-21]。miRNA代表了研究最多的非编码RNA类，负责调节高达60%的蛋白质编码基因表达[22]。miR⁃NA其中一个最重要特征在于其多靶点潜力，例如单个miRNA靶点多达200个mRNAs，而不同的miRNA可以调节相同的mRNA靶点[23]。外泌体miRNAs作为肿瘤基质-肿瘤细胞间信号交流的重要媒介，几乎参与了肿瘤发生发展的整个生物学过程[24,25]。血清外泌体miRNAs丰度较高、稳定性好，且更容易标准化，有望成为CRC早筛早诊、病情监测、疗效评估的新型生物标志物[26,27]。相关研究[28]表明，外泌体miRNAs在血液循环中能稳定存在的有以下原因：①外泌体纳米级别的直径大小可以避免被吞噬；②外泌体本身携带CD47、CD55和CD59等分子，可避免被循环单核⁃巨噬细胞清除而稳定存在；③miRNA具有囊泡膜保护，可免受体液中的酶类物质降解[29]。

2 外泌体miRNAs与CRC的发生、发展及转移

近年来很多研究表明外泌体miRNAs在CRC发生发展中扮演着重要角色。Bigagli E等[30]研究显示，外泌体miR-210高表达能减弱细胞间的相互作用及增强细胞迁移和侵袭性，这可能是促进结肠癌上皮-间质转换（epithelial-mesenchymal transitions,EMT）的机制之一。miR-92a是致癌miR簇miR-17-92的成员，位于染色体13q13，该区域促进细胞增殖、抑制癌细胞凋亡、诱导肿瘤血管生成，并加速CRC的进展[31]。Zhang G等[32]研究显示外泌体miR-92a在CRC中显著上调，导致E-cadherin下调及β-catenin和vimentin上调，从而通过PTEN（phosphate and tension homology de⁃leted on chromsome ten,PTEN）/胞内磷脂酰肌醇激酶（phosphoinositide 3’-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（ser⁃ine/threonine-specific protein kinase,Akt）途径与其靶标PTEN的相互作用参与调控EMT，PTEN是目前发现的第一个具有脂质磷酸酶活性的抑癌基因，在肿瘤发生发展中具有重要作用。miR-200c是miR-200家族的成员，主要参与调节CRC细胞中锌指结构转录因子中的E盒结合锌指蛋白（zinc finger E-box-binding pro⁃tein，ZEB），诱导miR-200c抑制ZEB1的表达，从而减少CRC细胞的侵袭和迁移[33]。PROX1可通过与前miR-9-2启动子结合抑制上皮钙黏蛋白编码基因表达，从而促进EMT[34]。叉头框（forkhead box，FOX）转录家族的两个成员FOXQ1和FOXM1是miR-320c的靶点，其参与EMT诱导过程。

外泌体miR-21作为致癌miRNAs，通过PTEN/PI3K/Akt信号通路下调大肠癌中PTEN的表达[35]。Bhome R等[36]使用小鼠模型研究显示外泌体miR-21从肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblast,CAF）转移到癌细胞增加了癌细胞的转移潜力，这归因于这种miRNA对不同的肿瘤抑制基因（如PTEN和PDCD4）具有抑制作用。Asangani I A等[37]报道称miR-21通过PDCD4 3’-UTR中的nt228-249-CDR的特定结合位点，负调控肿瘤抑制因子PDCD4，并促进CRC的侵袭和转移。失活的let-7a与高水平的KRAS、c-MYC及CRC的发生有关[38]，而let-7 KRAS rs712多态性与CRC风险增加相关[39]，鼠类肉瘤病毒癌基因途径的激活可以触发并上调某些致癌miRNAs（如miR-210、miR-181a、miR-200c），其在CRC发生发展和转移中起关键作用[40]。Sun D等[41]研究表明miR-31可通过直接识别RAS p21 GTP酶的3’-UTR的特定位置激活RASA1转录，促进CRC细胞的生长并刺激肿瘤发生。外泌体的间接作用也被描述为免疫系统的负调节因子，如骨髓源性抑制细胞、调节性T细胞和单核细胞。这些细胞有利于肿瘤逃脱免疫监视[42,43]。Takano Y等[44]研究表明CRC来源外泌体能够在体内启动肝脏转移前生态位的形成，并提出由CRC细胞释放的外泌体miR-203，由单核细胞内化，从而促进M2标记的表达。这表明外泌体miRNAs的可能参与单核细胞分化为M2-肿瘤相关巨噬细胞[45]。Wang X等[46]研究表明，CRC细胞释放的外泌体可能激活SDF1介导的基质细胞向肝脏生态位的趋化作用。这表明外泌体miRNAs通过招募表达CXCR4的细胞，包括免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞、骨髓来源细胞和干细胞，形成转移前微环境，促进CRC的肝转移。因此，在CRC的血清中检测到外泌体miR-203的高表达是一个独立的不良预后因素，与转移潜能增加和生存期缩短相关[44]。外泌体miRNAs在CRC发生及演进过程中发挥着至关重要的作用，几乎参与肿瘤发生发展的整个生物学过程。外泌体miRNA与CRC发生发展的具体机制有待进一步研究。

3 外泌体miRNAs在CRC临床中的应用

3.1 外泌体miRNAs作为CRC诊断与预后标志物 肿瘤来源的RNA被包装在外泌体磷脂双层内可避免血清核糖核酸酶的降解，是肿瘤患者诊断和预后评估的生物标志物，目前这项技术被称为“液体活检”[47]。Chen X等[48]研究发现，CRC患者与健康人血清中的miRNA的表达水平是不同的，已经确定至少有69种miRNAs分子只能在CRC患者的血清中被检测到。miR-21、let-7g、miR-31、miR-92a、miR-181b及miR-203这六种血清外泌体miRNA，已被证明是可靠的诊断CRC的生物标志物，与癌胚抗原（carcino embryonic antigen,CEA）和CA19-9等经典标志物相比，特异性和敏感性超过40%[49]。Ogata-Kawata H等[50]研究分析了CRC患者的血清外泌体miRNA，并将其与健康对照组进行了比较，鉴定出了16种差异表达的miRNA，包括：let-7a、miR-21、miR-23a、miR-150、miR-181b、miR-181d、miR-223、miR-483-5p、miR-638、miR-1224、miR-1229、miR-1246、miR-1268、miR-1290、miR-1308和miR-1915。进一步分析显示miR-1246和miR-23a的敏感性最高，分别为95%及92%，是有希望诊断CRC的生物标志物。Vychytilova-Falte js⁃kova P等[51]在144例CRC患者和96例健康人群血清中发现54个miRNAs显著下调，其中4个miRNA（miR-23a-3p、miR-27a-3p、miR-142p和miR-376c-3p）被确定为诊断性生物标志物，对早期CRC具有较高的鉴别能力（81%的敏感性和特异性，AUC=0.877）。Wang J等[52]研究证表明血清外泌体miR-125a-3p和miR-320c在部分CRC晚期患者中显著上调，血清外泌体miR-125a-3p和CEA的联合检测著着提高了早期诊断CRC的能力。有些外泌体miRNAs通过靶向ZEB1和ZEB2转录因子调控EMT与肿瘤转移相关[53]。Wang D S等[54]发现血清外泌体miR-103水平升高与淋巴结转移和晚期肿瘤分期有关，反映了它参与了CRC的进展。其他血清外泌体miRNAs，如miR-506、miR-4316、miR-182和miR-30a-5p也已被认为是早期CRC检测的潜在标志物[55-57]。Zhu M等[58]对来自196名CRC患者和138名健康人的血清样本检测中发现miR-19a-3p、miR-21-5p和miR425-5p的表达水平在CRC中显著升高。因此，在中风险CRC人群中检测这些血清外泌体miRNAs的表达水平可以作为一种筛查CRC的无创检测方法。

据相关研究[59,60]报道，血清外泌体miR-200c、miR-203与EMT相关，具有很强的生物标志物价值，可作为CRC预后和预测转移的指标。Tsukamoto M等[61]研究显示血清外泌体miR-21是II-III期CRC患者DFS和OS以及IV期CRC患者总生存期（overall sur⁃vival,OS）的独立预后生物标志物。血清外泌体miR-6803-5p高水平与CRC患者较短的无病生存期（dis⁃ease freesurvival,DFS）和OS显著且独立相关，在晚期患者及肝转移患者中预测价值更高[62]。其他血清外泌体miRNAs（例如miR-17-92a、miR-92、miR-638、miR-19a、miR-548c-5p、miR-27a、miR-130a）被认为与CRC患者预后不良相关[63,64]。这些外泌体miRNAs血清水平升高与淋巴/血管浸润或短期无进展生存期有关，有助于确定新的预后生物标志物，以早期识别肿瘤切除后复发风险高的患者[65-67]。这些都体现了血清外泌体miRNAs可作为CRC预后标志物，对CRC患者预后评估具有重要价值。

3.2 外泌体在CRC治疗中的应用 外泌体miR-21的高表达与5-氟尿嘧啶的化疗耐药有关。Valeri N等[68]证明miR-21的过表达直接靶向抑癌基因突变体人类DNA MutS同系物2（hMSH2）的3'-UTR，并显著下调其表达，从而显著降低5-FU诱导的G2/M损伤阻滞和凋亡。Deng J等[69]进一步研究显示miR-21过表达促进了细胞增殖和侵袭，抑制化疗药物5-FU对CRC HT29细胞的凋亡作用。外泌体miR-196b-5p的过表达也被认为是肿瘤干细胞通过靶向调节SOCS1和SOCS3（STAT3信号通路的两个负调控因子）对5-FU耐药的另一个标志[70]。Jin G等[71]研究发现了一组血 清 外 体miRNAs（miR-21-5p、miR-1246、miR-1229-5p及miR-96-5p），可以区分对常规化疗敏感的CRC患者，敏感性为78%，特异性为88.90%。以上研究对外泌体miRNAs与CRC化疗耐药关系进行了阐述，为CRC的临床治疗提供了新的思路和靶点。外泌体具有运送货物的生物学功能，Samanta S等[72]研究表明外泌体可以作为靶向药物的载体，精准地破坏肿瘤细胞。Dai S等[73]对腹水来源外泌体（ascites exosome，Aex）与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）联合应用于CRC患者的免疫治疗进行了I期临床试验。这种治疗发方法可能是一种有益的、肿瘤特异性的抗肿瘤细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic tlymphocyte,CTL）反应，可能给晚期CRC患者免疫治疗的提供新思路。Kamerkar S等[74]研究来自正常成纤维细胞样间充质细胞的外泌体可携带特定siRNA或短片的细胞发夹RNA（sh-RNAs）到KRASG12D胰腺癌细胞，其在多种小鼠模型中被证明具有良好的抗肿瘤活性。Zhao H等[75]研究显示癌症相关成纤维细胞衍生的外泌体包含完整的代谢产物，包括氨基酸、脂质和三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle,TCAcycle）中间体。癌细胞利用CDEs的中心碳代谢促进肿瘤在营养缺乏的条件下生长，因此，抑制肿瘤外泌体的释放或阻断肿瘤的外泌体miRNAs的功能也可能成为治疗CRC的新策略。

4 小结与展望

外泌体miRNAs是肿瘤细胞微环境中信号交流的重要媒介，几乎参与肿瘤发生发展的全部生物过程。许多研究表明CRC中异常表达的miRNA通常与CRC发生发展或转移相关。血清外泌体miRNA是一种很有潜力的诊断和治疗CRC的生物标志物，然而，外泌体miRNA在CRC中的作用机制、早期诊断、靶向治疗及预后评估等方面的研究仍具有巨大的挑战。对其深入研究及将相关问题不断完善，为发展优越的CRC筛查方法、治疗靶点及预后标志物开辟新前景，为更好的临床应用奠定基础。