脂肪干细胞培养上清液对体外培养人脐静脉血管内皮细胞的影响

闫静川，王洪涛，贾艳慧，白晓智，刘 洋，陈俏华

已有研究[1]显示，脂肪间干细胞（adipose derived stem cells,ADSCs）能够促进创面愈合与组织再生。ADSCs具有多项分化潜能，可转分化为多种修复细胞直接参与创面修复；另一方面，ADSCs可能通过旁分泌各种生长因子和免疫调节因子，调控创面炎症反应，促进角质形成细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞的增殖和迁移，从而加速创面的愈合[2]，但具体机制尚不清楚。血管的发生是一个包含多种修复细胞、细胞因子、生长因子以及机械力学、氧浓度等微环境因素参与的复杂过程，低氧环境诱导、机械牵张、血管内皮细胞生长因子（Vascular endothelial Growth Factor,VEGF）、血管紧张素Ⅰ（AngiotensinⅠ,AngⅠ）、炎性因子等均参与这一复杂过程[3]。血管内皮细胞作为主要效应细胞，增殖、迁移等生物学特性在血管发生中发挥关键作用[4]。我们体外培养人ADSCs并收集培养上清液，作为条件培养基，观察其对体外培养的人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）生物学特性的影响，初步探讨ADSCs通过旁分泌促进血管发生的相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 游离脂肪组织由空军军医大学第一附属医院烧伤外科提供，为全厚皮肤移植手术中修剪下废弃的脂肪，经患者同意后自愿捐赠。HUVECs购自美国模式培养物库，DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA购自美国GIBCO公司；Ⅰ型胶原酶、鼠抗人VEGF，AngⅠ抗体购自美国Sigma公司；Transwell小室购自美国Corning公司；兔抗鼠荧光标记二抗、兔抗鼠酶联标记二抗，β-actin多克隆抗体购自美国Abcam公司。倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；CO2培养箱、多功能酶标仪（Thermo公司，美国）。

1.2 ADSCs培养上清的收集 按照YAN LI[5]方法进行ADSCs的培养。简单步骤为，在无菌条件下将大块的脂肪用含1%双抗的PBS反复冲洗三遍，后放入10 cm平皿中，剪成糜状，加入0.1%Ⅰ型胶原酶，充分混匀后置于37℃恒温箱，100 rpm消化40 min-60 min。100目钢丝滤网过滤去除没有消化的杂质，1000 rpm，离心10 min，弃去上清，用含10%胎牛血清的人ADSCs专用培养基5 mL重悬细胞沉淀，接种到25 cm2培养瓶中，置于孵箱常规培养和传代。实验选取3-5代细胞，待细胞长至75%-85%融合度时，PBS冲洗，无血清DMEM培养基饥饿培养24 h，收集上清备用，将上清与DMEM培养基按照1：1混合，并加入10%胎牛血清，作为实验组条件培养基，含10%的胎牛血清的DMEM培养基为对照组。

1.3 HUVECs的复苏和传代 HUVECs来从液氮中取出细胞冻存管，立即置于37℃细胞复苏水浴锅中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，反复吹打混匀后1000 rpm离心3 min；弃去上清液后重悬，移至培养瓶中培养；待内皮细胞生长接近融合时用0.25%EDTA的胰蛋白酶溶液消化，传代培养。

1.4 MTT增殖实验 使用MTT测定法检测细胞增殖，将HUVECs按每孔1×104接种到96孔板中，培养24 h、48 h、72 h后，分别向每个孔中加入20μL浓度为5 g/L的MTT并孵育4 h。弃去上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜并震荡混匀15 min，490 nm波长酶联免疫仪测取吸光度值。

1.5 划痕实验 将HUVECs接种于6孔板中，每孔1×105个细胞，待细胞80%铺满，PBS清洗2次，10μg/mL丝裂霉素37℃孵育1 h，用200μL吸头在细胞培养孔中央垂直划一直线，PBS清洗2次，分别加入实验组和对照组培养基，于划痕后即刻、24 h、48 h显微镜拍照，每次拍照固定相同位置，测量各时间点划痕宽度，计算愈合速度，比较细胞迁移快慢。

1.6 Transwell迁移实验 将Transwell小室插入24孔板中，向小室中加入100μL HUVECs 1×104/孔，置于培养箱培养1 h。实验组下室更换为条件培养基，对照组下室更换为普通培养基，置于培养箱中继续培养12 h。用棉签刮去上室未迁移细胞，并将小室用多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色15 min，显微镜下观察迁移细胞并计数，重复6次取平均值。

1.7 免疫荧光染色 将载玻片放入6孔培养板中，分别接种HUVECs 1×105个细胞/孔。待细胞70%融合后，PBS清洗2次，实验组和对照组分别加入条件培养基和普通培养基，24 h后，PBS清洗，4%多聚甲醛固定10 min，0.1%Triton/PBS室温中处理15 min，甲醇新配置0.3%双氧水室温孵育15 min，5%BSA/PBS于37℃下封闭2 h，分别滴加1:100的鼠抗人一抗，4℃下孵育过夜，PBS洗涤×3次。1:50的Cy3标记兔抗小鼠二抗，37℃下孵育1h，PBS洗涤×3次，DAPI室温孵育30 min，PBS洗涤×3次，防荧光淬灭封片剂封片后，显微镜拍照。

1.8 Westernblot 不同条件培养基培养条件下HU⁃VECs达到80%铺满时，RIPA强细胞裂解液作用30 min，后取上清液进行蛋白定量。取50μg总蛋白，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿法转膜至硝酸纤维素膜，用5%牛血清白蛋白封闭1 h。加入1:1000一抗工作液（VEGF、AngⅠ），4℃孵育过夜；加入1：2000辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗，室温下作用2 h。化学发光法显影，曝光。以相应蛋白条带的积分光密度值，除以GAPDH的值表示目的蛋白的相对含量。

2 结果

2.1 MTT结果 与普通培养基相比，条件培养基在接种24 h、48 h和72 h，HUVECs增殖明显增快，统计学差异显著。见表1。

表1 不同培养基对HUVECs增殖的影响

2.2 细胞划痕实验 实验结果显示在第24 h和48 h，条件培养基细胞划痕宽度明显小于对照组，提示条件培养基可以促进HUVECs迁移。见图1。

图1 划痕实验检测不同培养基对HUVECs迁移的影响

2.3 Transwell实验 UVECs接种于Transwell小室培养12h发现，条件培养基组迁移至小室背面细胞数与对照组相比明显增加。见表2。

表2 Transwell检测不同培养基对HUVECs迁移的影响

2.4 免疫荧光染色 免疫荧光染色结果显示，与普通培养基相比，条件培养基培养条件下的HUVECs表达VEGF和AngⅠ明显增高。见图2。

图2 免疫荧光检测不同条件培养基培养下HUVECs的VEGF、AngⅠ表达

2.5 Westernblot结果 Westernblot结果显示，与普通培养基相比，条件培养基培养条件下的HUVECs表达VEGF和AngⅠ明显增高。见图3。

图3 Westernblot检测不同条件培养基培养下HUVECs的VEGF、AngⅠ表达情况

3 讨 论

近年来，间充质干细胞在组织修复与再生中的作用日益受到重视。与其他干细胞相比，脂肪来源的间充质干细胞具有来源丰富、容易获取等优点，具有更广阔的临床应用前景。研究[6]表明，ADSCs具有多项分化潜能，可以分化为内皮细胞，直接参与血管的再生，并有望用于缺血性疾病的治疗。最近研究[2,4]显示，干细胞真正在体内的转分化作用是微乎其微的，无论自体或者异体局部注射干细胞大多数都以排斥清除的方式结束，干细胞的修复作用更多的是通过旁分泌及促进靶细胞的自分泌实现的。ADSCs可以通过旁分泌TNF-α，IFN-γ，TGF-β，VEGF等，促进新生血管的形成[7]。Lee EY等[8]研究发现，低氧诱导条件下，ADSCs能够分泌低氧诱导因子1α（HIF-1α），与常氧条件下培养的ADSCs相比，诱导血管发生能力更强。Chen等[9]研究发现，ADSCs中分泌单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1,MCP-1）、VEGF、血管紧张素等，均促进新生血管的发生。除此之外，ADSCs还能分泌一些免疫抑制因子、神经营养因子、细胞外基质蛋白、酶以及小分子核糖核酸mi⁃croRNA（miRNA）等[10]，这些成分不但可以促进细胞的增殖、分化和生存，还可以减少炎症反应，提高修复速度和愈合质量[11]。近年研究[12,13]发现，ADSCs能够分泌生物活性成分中含有一种50 nm-150 nm的颗粒，称为外泌体（Exo），ADSCs-Exo外泌体中包含蛋白、脂质体、mRNA，miRNA等，而miRNA可能发挥了轴心作用，可以通过对靶细胞的调控发挥作用。外泌体化学性质稳定、生物安全性高、移植后无免疫排斥，是干细胞研究领域的新兴热点[14]。

血管的形成需要内皮细胞的增殖和迁移，以及内皮细胞、血管生成因子等与周围蛋白之间的相互作用。在趋化作用下，内皮细胞穿透血管基底膜，侵入细胞外基质并形成管状结构，继续延伸，分支并形成网络。VEGF/VEGF-R通路在这一过程中发挥重要作用，可以诱导相关基金表达，调控血管渗透性，促进血管内皮细胞增殖、迁移，抑制细胞凋亡[15]。我们通过提取ADSCs培养上清与HUVECs共培养，发现能够促进体外培养的HUVECs增殖和迁移，并表达VEGF，AngⅠ等，初步阐明ADSCs可以通过旁分泌促进新生血管的发生。而由于ADSCs培养上清不含细胞成分，免疫原性低，无潜在致瘤性风险，克服了细胞治疗临床应用的局限性，且易于携带、转运和保存，有望替代干细胞移植，形成临床标准化治疗方案。