雷极普罗威登菌临床株对碳青霉烯酶类耐药的分子机制

杨元铭 李笃军 王晓慧 刘入华 王斌 朱元祺

雷极普罗威登菌属于肠杆菌目,是临床上重要的条件致病菌,可引起儿童或成人的泌尿道、呼吸道、伤口、脑脊液或血流的感染［1,2］。由于该菌对替加环素和多粘菌素天然耐药,一旦雷极普罗威登菌呈现产碳青霉烯酶,这将使临床医师对抗感染治疗药物的选择面临困难,甚至可能出现无药可用的局面［3］。因此,本研究对分离自患儿脑脊液感染的耐碳青霉烯类雷极普罗威登菌QD51 临床株利用PCR 和高通量测序对其耐药机制进行研究,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验菌株 耐碳青霉烯类雷极普罗威登菌临床株QD51 于2014 年11 月分离自颅内感染患儿的脑脊液标本。电泳分子量标记的沙门菌H9812、药敏质控菌株ATCC25922 和质粒受体菌大肠埃希菌 J53AziR为本实验室保存。

1.2 实验仪器和试剂 细菌鉴定和药敏采用法国生物梅里埃VITEK-2 Compact 系统,药敏判定标准依据CLSI-2019［4］。美国BIO-RAD 公司的PCR 扩增仪、脉冲场电泳仪和凝胶成像系统。大连宝生生物的核酸分子量标准、琼脂糖和PCR 试剂。

1.3 扩增碳青霉烯酶基因 依据文献［5］依次扩增碳青霉烯酶耐药基因,生工(上海)生物工程有限公司完成引物合成和扩增产物测序。

1.4 质粒接合、S1-PFGE 参照文献［6］操作,电泳条件：转换时间0.3～45.0 s,转角120,场强6 V,电泳时间18 h。

1.5 质粒的高通量测序 基于Illumina MiSeq 和MinION 平台对接合子携带的质粒测序,然后,利用ResFinder 等软件分析质粒。

2 结果

2.1 碳青霉烯酶基因、质粒接合和药敏结果 PCR 扩增雷极普罗威登菌QD51 株的碳青霉烯酶基因,结果显示该株NDN 基因阳性,经测序比对为NDM-1 型,但其他碳青霉烯酶耐药基因未检测到。雷极普罗威登菌QD51 株与受体菌大肠埃希菌J53AziR经液相接合,获得了接合子QD51C,经扩增和测序验证该接合子也携带NDM-1 基因,表明接合成功。供体菌雷极普罗威登菌QD51、接合子QD51C 和受体菌大肠埃希菌J53AziR的药敏结果。见表1。

表1 雷极普罗威登菌QD51 株和接合子QD51C 及大肠埃希菌J53AziR 的药敏

2.2 质粒的S1-PFGE 和高通量测序结果 对雷极普罗威登菌QD51 株与接合子QD51C 的S1-PFGE 显示,两者都携带1 个质粒,大小约138 kb,将该质粒命名为pNDM-QD51,电泳结果见图1。利用高通量测序平台获得了质粒pNDM-QD51 的全序列(GenBank:MH236906),然后经软件分析质粒的生物信息,结果显示：质粒pNDM-QD51 全长为134802 bp,属于IncA/C 型,且含有blaNDM-1和blaCMY-6基因；该质粒包含骨架区和附属区；骨架区主要包括质粒复制起始、稳定性和接合转移基因；附属区又包含了ISEcp1-blaCMY-6unit 和MDR region of pNDM-QD51。

图1 雷极普罗威登菌S1-PFGE 电泳图

3 讨论

近十几年来,由于不合理使用抗菌药物,耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌的分离率逐年增加。除了常见的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌外,耐碳青霉烯类雷极普罗威登菌在国内外也都有报道。这些菌对碳青霉烯类的耐药机制主要与其产碳青霉烯酶有关［3］。

NDM-1 为2010 年发现的金属酶,属于B 类β-内酰胺酶,由blaNDM-1基因编码。除了氨曲南外,该酶对包括碳青霉烯类在内的β-内酰胺类抗菌药物耐药［7］。已报道blaNDM-1基因常常分离自肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和阴沟肠杆菌等。但是,NDM-1 雷极普罗威登斯菌属的相关报道较少。本研究为中国儿童感染产NDM-1 的雷极普罗威登斯菌的报道。该雷极普罗威登菌QD51 株呈现对哌拉西林/他唑巴坦、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、而他培南、亚胺培南、美罗培南、磷霉素素和环丙沙星不敏感或耐药,而且通过接合试验传递给接合子。

研究发现,blaNDM-1基因多数位于质粒上,而携带该基因质粒的的水平传播是产NDM-1 细菌广泛流行的主要原因。这些质粒大小在50000～340000 bp 之间不等［8］,并通过接合转移到其它菌株中,从而使其它菌株获得抗性。另外,blaNDM-1基因多数位于广宿主质粒,如IncA/C 和IncL/M,但也可以在窄宿主质粒上发现,即,表示在不同种属之间可以快速传播。本研究利用高通量测序获得了雷极普罗威登菌QD51 株携带的质粒pNDM-QD51 的全序列,其全长为134802 bp,属于IncA/C 型,且含有blaNDM-1和blaCMY-6基因。该质粒骨架区主要包括质粒复制起始、稳定性和接合转移基因,而附属区包含了ISEcp1-blaCMY-6unit 和MDR region of pNDM-QD51 两部分。这与Humberto 等［9］报道的普罗威登菌携带blaNDM-1基因质粒为310,000 bp 不尽相同。另外,雷极普罗威登菌blaNDM-1基因也可位于染色体上,表明该基因既可以通过质粒在同种或不同种细菌之间传播,还可以整合到细菌染色体上进行重组传播［10］。

产NDM-1 细菌往往同时携带其它的耐药基因,如分离株P.stuartii PS1 同时携带TEM-1、OXA-1、CMY-6 和RmtC 基因［10］。在本研究中,雷极普罗威登菌QD51 株还携带blaCMY-6基因,表现对碳青霉烯类和头孢菌素类耐药。由于雷极普罗威登菌对替加环素和多粘菌素天然耐药,患者又是儿童,这对临床抗感染治疗药物是一个棘手的问题。

综上所述,本研究表明雷极普罗威登菌临床株QD51 对碳青霉烯酶类耐药与其blaNDM-1和blaCMY-6基因有关,应引起临床重视,并加强医院感染的的监测和抗生素的合理应用。