不同演替阶段下球囊霉素相关土壤蛋白对团聚体稳定性的影响

邸涵悦，郝好鑫, ，孙兆祥，姜海，程谅, ，郭忠录*

1.华中农业大学水土保持研究中心，湖北 武汉 430070；2.长江水资源保护科学研究所，湖北 武汉 430051；3.丹江口市水土保持监测站，湖北 丹江口 442700；4.中国电力工程顾问集团中南电力设计院有限公司，湖北 武汉 430071

1996年，美国马里兰大学的Wright et al.（1996）在丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhiza fungi，AMF）菌丝表面发现了一种能够和单克隆抗体（MAb32B11）发生免疫性荧光反应的蛋白质。进一步研究发现，球囊霉素主要是由AMF所分泌的，AMF能够与大多数植物物种形成共生体，当菌丝死亡后球囊霉素从菌丝表面脱落进入根际土壤中。由于现有的提取方法从土壤中提取出的蛋白还含有其他非球囊霉素成分，所以Rosier et al.（2006）认为，用“球囊霉素相关土壤蛋白”（Glomalin-related soil protein，GRSP）代替球囊霉素更为合适。研究发现，一方面GRSP具有较强的黏附土壤颗粒的能力（Wright et al.，1998），它能将较小的土壤颗粒粘聚成为微团聚体，进而形成一个较稳定的土壤单位（彭思利等，2010）；另一方面GRSP在土壤碳固定及循环过程中起着重要作用，其对土壤碳和氮库作出的贡献远超出土壤中活性微生物的贡献（Rillig et al.，2001）。

丹江口水库是中国南水北调中线工程的水源地，流域良好的生态环境对水库长期安全稳定运行起重要作用。土壤团聚体是土壤结构的基本单元，团聚体稳定性与土壤有机碳储存与固定关系密切，是评价土壤质量和健康的重要指标之一（朱兴菲等，2018）。研究表明植被演替过程对团聚体稳定性、GRSP均有影响。赵世伟（2012）就植被演替过程中土壤有机碳（Soil organic carbon，SOC）和团聚体稳定性的关系进行了探讨，结果显示随着植被群落的恢复，土壤总有机碳含量和土壤固碳能力明显提高，土壤的团聚体平均质量直径逐渐增加，即土壤结构稳定性提高。阙弘等（2015）的研究表明，0—40 cm土层中总量球囊霉素相关土壤蛋白（Total Glomalin-related soil protein，T-GRSP）和易提取球囊霉素相关土壤蛋白（Easily extractable Glomalin-related soil protein，EE-GRSP）含量均表现为林地高于草地。孙利鹏（2018）研究发现，随着植被恢复年限的增加，GRSP和有机质含量升高，团聚体稳定性指数增加，表明在植被恢复过程中GRSP对团聚体稳定性的提高及固碳作用的增强有显著影响。然而，随着演替的进行，GRSP和SOC对植被恢复的响应程度、团聚体有机碳的保护机制等问题尚不完全清楚。为此，本研究以胡家山小流域植被恢复过程中典型演替阶段为研究对象，对其团聚体稳定性、GRSP和SOC分布特征进行分析，对比不同演替阶段、不同土壤深度下GRSP与团聚体稳定性、土壤有机碳之间的关系，为丹江口地区植被恢复提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区位于湖北省丹江口市胡家山小流域（ 111°12′22″— 111°15′20.5″E，32°44′17.8″—32°49′15.6″N），该地区属于亚热带半湿润季风气候，多年平均气温 16.1 ℃，多年平均降水量 798 mm。流域内主要土壤类型包括紫色土、石灰土和黄棕壤。自然植被为温性常绿针叶林、暖性常绿针叶林、落叶阔叶林、常绿阔叶林、针阔叶混交林、灌丛和草丛等。

1.2 样品采集

土壤样品采集在2018年8月进行，实验于2018年 10—12月在华中农业大学资源与环境学院实验室进行。选取研究区植被恢复过程中5种典型演替阶段，即裸地、草地、灌木林、乔木林、乔灌混合林为研究对象，在每个样地选择4个植被盖度较为一致的样方（裸地、草地1 m×1 m，灌木林5 m×5 m，乔木林、乔灌混合林10 m×10 m）进行地上植被调查和土壤样品的采集。其中裸地无优势种，草地优势种包括白茅（ImPeratacylindrica）、小蓬草（Conyzacanadensis）、牛筋草（Eleusineindica）、荩草（ArthraxonhisPidus），灌木林优势种包括酸枣（ZiziPhusjujuba）、乌桕（SaPiumsebiferum）、白刺花（SoPhoradavidii）、小薹草（CarexParva）、杜荆（Vitexnegundo）、鸡眼草（Kummerowiastriata），乔木林优势种包括侧柏（Platycladusorientalis）、小薹草（C.Parva），乔灌混合林优势种包括侧柏（P.orientalis）、杜荆（V.negundo）、白刺花（S.davidii）、小薹草（C.Parva）。在选取的典型样地的对角线上挖掘3个土壤剖面，并自下而上采集0—10、10—20、20—30 cm土壤深度的土样，3个剖面中相同层次的土样进行混合，用四分法分取适量土样装入铝盒，并用标签记录采样信息。带回实验室后，去除土样中的杂物、细根，部分土样风干、碾碎后过0.105 mm孔径土壤筛备用，其余土样沿土壤裂隙掰成小块并过筛，选取3—5 mm土样备用。

1.3 研究方法

土壤容重和毛管孔隙度采用环刀法测定。有机碳采用重铬酸钾外加热法测定（鲍士旦，2000）。土壤团聚体稳定性采用 LB法测定（Le Bissonnais，1996）。将风干获得的3—5 mm团聚体在40 ℃条件下烘干24 h，使样品初始含水量一致。而后分别进行如下3种处理，（1）快速湿润（FW），将称得的5 g团聚体迅速浸没在去离子水中，10 min后用针管吸多余的水分。该处理模拟暴雨条件下团聚体的破坏过程。（2）预湿润振荡（WS），将称得的5 g团聚体迅速浸没在酒精中，排出团聚体颗粒中的空气，10 min后用移液管吸掉酒精，将团聚体转入盛有50 mL去离子水的锥形瓶中，加水到200 mL，加塞封盖后上下振荡20次，静置30 min使其沉淀，然后用针管吸掉多余水分。该处理模拟机械外力作用下，例如雨滴打击或径流冲刷对团聚体的破坏作用。（3）慢速湿润（SW），将称得的5 g团聚体置于张力为−0.3 kPa的湿润滤纸上，静置30—40 min后团聚体完全湿润。该处理模拟地表湿润条件下，土壤通过毛管引力吸水从而造成团聚体破坏。将上述3种处理的团聚体转移到沉浸在95%酒精中的筛子（0.05 mm）上，上下振荡20次，每次振幅约2 cm，然后转入烧杯中，在40 ℃的烘箱中烘干酒精。干筛过2、1、0.5、0.25、0.105 mm土壤筛，称得每个粒级的破碎团聚体质量。每个处理设置3组重复。

团聚体稳定性指标采用以下公式计算：

式中，MWD为平均质量直径（mm）；ri为筛组中第i个筛的孔径（mm），r0=ri，rn=rn+1；wi为第i个筛上的破碎团聚体质量分数；n为筛子个数。

球囊霉素相关土壤蛋白采用考马斯亮蓝法测定（Wright et al.，1998）。EE-GRSP：取 0.5 g 风干土于试管中，加入 4 mL 的 20 mmol·L−1（pH 7.0）柠檬酸钠溶液，在121 ℃、103 kPa的高压灭菌锅中提取30 min，冷却后离心5 min（10000 g），收集上清液；T-GRSP：取0.5 g风干土于试管中，加入4 mL 的 50 mmol·L−1（pH 8.0）柠檬酸钠溶液，在121 ℃、103 kPa的高压灭菌锅中提取60 min，冷却后离心5 min（10000 g），收集上清液，重复提取直到上清液基本无色。分别吸取上清液1 mL加入5 mL考马斯亮蓝染色剂，在595 nm波长下比色。用牛血清蛋白标液，考马斯亮蓝法显色，绘制标准曲线，计算EE-GRSP和T-GRSP含量。

1.4 数据处理与分析

本文中利用Excel 2016对数据进行整理，利用SPSS 17.0软件基于邓肯法对不同演替阶段和不同土壤深度进行单因素方差分析（P＜0.05）；对GRSP和SOC与LB法3种处理方式下MWD和＞0.25 mm团聚体含量进行Pearson相关分析；对GRSP和SOC对团聚体稳定性指标的影响进行多元逐步回归分析。利用Origin 2017软件绘图。

2 结果

2.1 不同演替阶段下土壤理化性质

不同演替阶段之间土壤有机碳存在显著差异，0—10 cm 土层 SOC 含量介于 2.10—15.65 g·kg−1，乔木林和乔灌混合林的 SOC含量显著高于裸地和草地（P＜0.05），10—20 cm 土层 SOC 含量介于1.51—10.81 g·kg−1，乔木林 SOC 含量显著高于裸地和草地（P＜0.05），20—30 cm土层SOC含量介于0.60—3.64 g·kg−1，裸地 SOC 含量显著低于其他演替阶段（P＜0.05）。同一演替阶段，不同土壤深度SOC含量表现为0—10＞10—20＞20—30 cm。草地、灌木林、乔木林和乔灌混合林0—30 cm平均SOC含量分别是裸地的2.9、4.9、7.3和5.8倍。同一土壤深度中不同演替阶段土壤容重无明显变化规律，同一演替阶段下容重随土壤深度的增加表现出增高的趋势。不同土壤深度中乔木林和乔灌混合林毛管孔隙度较大（表1）。

表1 不同演替阶段土壤性质Table 1 Soil properties as affected by different succession stages

2.2 不同演替阶段下GRSP分布特征

不同演替阶段EE-GRSP和T-GRSP含量都随土壤深度的增加而降低，不同演替阶段下在 0—30 cm土层均存在显著差异（P＜0.05）。这是由于表层土壤中AMF含量更为丰富，能够产生并积累更多的球囊霉素。裸地EE-GRSP含量最低，在0—20 cm显著低于灌木林、乔木林和乔灌混合林，在20—30 cm显著低于草地、乔木林和乔灌混合林（P＜0.05）。草地、灌木林、乔木林和乔灌混合林0—30 cm平均EE-GRSP含量分别是裸地的3.0、6.5、9.8、10.2倍。裸地T-GRSP含量最低，在0—10 cm显著低于灌木林、乔木林和乔灌混合林，在10—30 cm显著低于乔木林和乔灌混合林（P＜0.05）。草地、灌木林、乔木林和乔灌混合林0—30 cm平均T-GRSP含量分别是裸地的3.6、13.4、27.6、21.2倍。灌木林和乔灌混合林的 EE-GRSP/T-GRSP比值随土壤深度的增加而显著升高（P＜0.05）。0—10 cm 土层中 EEGRSP/T-GRSP比值介于24.1%—73.8%，灌木林、乔木林和乔灌混合林的 EE-GRSP/T-GRSP比值显著低于裸地和草地，10—20 cm土层中EE-GRSP/TGRSP比值介于 32.5%—77.4%，乔木林的 EEGRSP/T-GRSP比值显著低于裸地和草地（P＜0.05），20—30 cm土层 EE-GRSP/T-GRSP比值介于58.0%—85.3%，不同演替阶段EE-GRSP/T-GRSP比值无显著差异（P＞0.05）。与裸地相比，草地、灌木林、乔木林和乔灌混合林在 0—30 cm土层的 EEGRSP/T-GRSP平均值分别降低了 6.4%、21.2%、52.5%和41.5%（图1）。

图1 不同演替阶段球囊霉素相关土壤蛋白差异Fig.1 Differences in GRSP in different succession stages

2.3 不同演替阶段下团聚体特征

总体上不同处理方式下团聚体稳定性从大到小依次为MWDWS、MWDSW、MWDFW。同一土壤深度同一处理方式下，不同演替阶段MWD和＞0.25 mm团聚体占比均有显著差异（P＜0.05）。在FW处理下同一土壤深度不同演替阶段MWD和＞0.25 mm团聚体占比差异最明显，基本表现为乔木林和乔灌混合林最高，其次是灌木林，最后是草地和裸地。FW 处理下，灌木林、乔木林和乔灌混合林不同土壤深度间MWD差异显著；WS处理下，乔木林和乔灌混合林不同土壤深度间 MWD差异显著；SW处理下灌木林、乔木林和乔灌混合林不同土壤深度间 MWD 差异显著（P＜0.05）。随着土壤深度的增加，MWD基本呈减小趋势。FW处理下，草地、灌木林、乔木林和乔灌混合林不同土壤深度间＞0.25 mm团聚体占比差异显著；WS处理下，乔木林和乔灌混合林不同土壤深度间＞0.25 mm团聚体占比差异显著；SW 处理下草地、灌木林、乔木林和乔灌混合林不同土壤深度间＞0.25 mm团聚体占比差异显著（P＜0.05）。FW处理下，草地、灌木林、乔木林和乔灌混合林0—30 cm平均MWD分别是裸地的1.28、1.62、2.46和2.48倍；WS处理下分别为0.93、1.11、1.19和1.16倍；SW处理下分别为1.27、1.49、1.84和1.86倍（图2）。

图2 不同演替阶段土壤团聚体稳定性Fig.2 Soil aggregate stability in different succession stages

2.4 团聚体稳定性与GRSP和SOC之间的关系

EE-GRSP、T-GRSP和SOC与LB法3种破坏机制下MWD和＞0.25 mm团聚体占比均有极显著正相关关系（P＜0.01）。其中与EE-GRSP相关性最好的是MWDSW，其次为MWDFW；与T-GRSP相关性最好的是MWDSW和MWDFW；与SOC相关性最好的是MWDSW，其次为MWDFW。而EE-GRSP/SOC与团聚体稳定性指标无显著相关关系，TGRSP/SOC与FW处理下团聚体稳定性指标有极显著正相关关系（P＜0.01），与SW处理下团聚体稳定性指标有显著正相关关系（P＜0.05），与WS处理下团聚体稳定性指标无相关关系。FW、SW处理下团聚体稳定性指标与EE-GRSP最为相关，WS处理下聚体稳定性指标与T-GRSP最为相关（表2）。

表2 SOC和GRSP及其比值与团聚体稳定性之间的相关关系Table 2 Relationship between SOC and GRSP and their ratios to soil aggregate stability

为了更好地探究EE-GRSP、T-GRSP和SOC对于6种团聚体稳定性指标的影响水平，对EE-GRSP、T-GRSP、T-GRSP/SOC和SOC这4个因素进行多元逐步回归分析。分析结果显示，在FW处理下，EE-GRSP对团聚体稳定性的影响最大，能够解释MWD 变化的 85.6%，EE-GRSP 每升高 1 mg·g−1导致MWD增大1.194 mm，T-GRSP/SOC是第2顺次引入的因子，R2adj提高至89.4%。EE-GRSP能够解释＞0.25 mm团聚体变化的81.9%，EE-GRSP每升高 1 mg·g−1导致＞0.25 mm 团聚体增多 44.38%，TGRSP/SOC的引入将R2adj提高至86.7%。在WS处理下，仅有 T-GRSP被选入回归方程，能够解释MWD 变化的 62.5%，T-GRSP 每升高 1 mg·g−1导致MWD增大0.116 mm，能够解释＞0.25 mm团聚体变化的 68.2%，EE-GRSP 每升高 1 mg·g−1导致＞0.25 mm团聚体增多3.972%。在SW处理下，仅有EEGRSP被选入回归方程，能够解释 MWD变化的87.2%，EE-GRSP 每升高 1 mg·g−1导致 MWD增大1.093 mm，能够解释＞0.25 mm团聚体变化的68.4%，EE-GRSP 每升高 1 mg·g−1导致＞0.25 mm 团聚体增多37.758%。根据逐步回归分析的显著性检验，3种处理的 SOC变量均不显著，因此未被选入回归方程（表3）。

表3 SOC和GSRP及其比值与团聚体指标逐步回归结果分析表Table 3 Multiple stepwise regression analysis between SOC and GRSP and their ratios to soil aggregate stability indexes

3 讨论

3.1 不同演替阶段球囊霉素相关土壤蛋白的差异

本研究中EE-GRSP和T-GRSP含量均随土壤深度的增加而逐渐下降，不同演替阶段存在显著差异（P＜0.05）。这是由于枯落物、根系分泌物和微生物在土壤表层聚集（王振等，2013），导致表层土壤养分较高，AMF活性强，AMF的侵染率和孢子密度大，从而释放更多的球囊霉素（Bauer et al.，1994）。本研究中灌木林、乔木林和乔灌混合林的GRSP含量较高，这是由于在乔灌木的覆盖下，土壤中根系分布更密集，利于AMF与植物根系形成共生体，进而增加GRSP含量。

本研究中，相同土壤深度下乔木林和乔灌混合林EE-GRSP/T-GRSP比值低于裸地和草地，这可能是由于易提取球囊霉素是土壤中新近产生的与土壤结合不紧密的球囊霉素（Lovelock et al.，2004），总提取球囊霉素含量则较稳定，而裸地和草地土壤中缺少使易提取球囊霉素与土壤紧密结合的条件，因此其中 EE-GRSP/T-GRSP比值较大。而阙弘等（2015）的研究中林地和草地土壤中 EE-GRSP/TGRSP比值显著高于耕作土壤，他认为人为干扰（如施用化肥、农药）会降低AMF丰富度和活性，减少土壤中球囊霉素的产生，并加速球囊霉素分解，且使土壤中易提取球囊霉素易于向总球囊霉素转化。本研究中EE-GRSP/T-GRSP比值随土壤深度的增加而上升，与阙弘等（2015）的研究结果一致，而朱兴菲等（2018）的研究结果中农地、核桃和侧柏样地土壤 EE-GRSP/T-GRSP比值随土壤深度的增加而降低，苜蓿和刺槐样地土壤 EE-GRSP/TGRSP比值随土壤深度的增加而上升。由于 EEGRSP和T-GRSP含量均随土壤深度的增加而逐渐下降，因此EE-GRSP/T-GRSP比值随土壤深度的变化，取决于EE-GRSP和T-GRSP含量随土壤深度变化的快慢，所以不同研究中该比值呈现出不同的变化规律。

3.2 不同演替阶段土壤团聚体稳定性的差异

本研究结果显示不同演替阶段和不同土壤深度中土壤团聚体稳定性有所不同，与李鉴霖等（2014）、陈国靖等（2018）的研究结果一致。有研究表明，植物释放的根系分泌物可以影响土壤中的微生物和土壤的物理性质，根系分泌物中的多糖对土壤颗粒有很强的黏着力，进而促进土壤团聚化。而且乔灌混合林和乔木林土壤根系数量多、分布深，根系通过穿插、挤压和缠绕等物理作用，也能增加土壤中的大团聚体。植被群落演替过程中，土壤中粉+黏团聚体（＜0.053 mm）的含量逐渐减少，粉+黏团聚体黏合形成的微团聚体（0.053—0.25 mm）和中间团聚体（0.25—2 mm）含量逐渐增加，土壤团聚体稳定性逐渐提高。宋日等（2009）认为，不同的植物根系分泌物提高团聚体稳定性的大小也不同，这种差别是由于根系分泌物成分组成和根际微生物种类不同，分泌含碳多的有机物有利于土壤稳定性结构的形成。还有研究认为土壤团聚体稳定性与细根密切相关（Hao et al.，2020）。细根通过与菌根真菌相互作用产生的渗出物和结合剂促进了土壤团聚体的形成，并增强了土壤团聚体稳定性（Eisenhauer et al.，2011）。

郭曼（2009）认为植被群落正向演替与土壤性质改善互为动力，互相影响。一方面随着演替的进行，植被覆盖度和多样性增加，植物产生的枯枝落叶和根系腐解物回归土壤，使土壤的理化性质得到改善；另一方面腐解过程中产生的酸类物质可以促进土壤中难溶性物质向可供植物吸收利用的有效物质转化，进而形成良性循环。同样的，演替与团聚体稳定性提高也是互为动力，互相影响。一方面随着演替的进行，植被覆盖度增大，减缓雨滴对土壤的打击能力，减少地表径流，同时根系数量增多、分布加深，根系分泌物增多，土壤有机碳逐渐积累，都为大团聚体的形成提供有利条件；另一方面团聚体稳定性的提高意味着在相同的降雨条件下，土壤团聚体更不易被破坏，提高土壤的抗侵蚀能力同时也增强了水土保持的能力，为植被的生长和植被群落的演替提供了更好的环境。因此，通过植被恢复或其他措施提高地表覆盖度，减少雨水对土壤团聚体的破坏，提高土壤抗侵蚀能力是解决土壤侵蚀问题的重要途径。

3.3 球囊霉素与团聚体稳定性的关系

LB法是模拟不同湿润破坏机制下团聚体稳定性的研究方法，其中FW处理模拟夏季大雨或暴雨时的消散作用，WS处理模拟雨滴打击时的机械破碎作用，SW 处理模拟温和降雨时团聚体内部黏土矿物不均匀胀缩导致的破坏（Le Bissonnais，1996）。一方面，本研究中FW处理对团聚体破坏性最大，说明暴雨是破坏研究区内土壤团聚体的主要因素。另一方面，逐步回归结果显示EE-GRSP对FW处理和 SW 处理下团聚体稳定性指标的解释效果最好，T-GRSP对WS处理下团聚体稳定性指标的解释效果更好，可见 EE-GRSP含量的升高对土壤团聚体抵抗消散作用和不均匀胀缩作用都有很大影响，而T-GRSP的升高对团聚体抵抗机械破碎作用有很大影响。已有研究指出土壤中的球囊霉素黏附土壤颗粒的能力比其他糖类物质高 3—10倍（Franzluebbers et al.，2000）。GRSP可以识别和保护有助于团聚体稳定性的多糖和微生物等（Oades，1984），能够保护 SOC不被分解，促进 SOC的积累，提升团聚体稳定性（Zhang et al.，2015）。景航等（2017）的研究发现不同粒径团聚体 T-GRSP、EE-GRSP含量与团聚体稳定性参数之间的关系有所差异，其中＞0.25 mm团聚体T-GRSP、EE-GRSP含量均与团聚体稳定性参数显著相关，说明团聚体稳定性更依赖于大团聚体GRSP。

4 结论

（1）植被演替有助于土壤质量的提升和团聚体的稳定。乔木林和乔灌混合林覆盖下土壤的 GRSP含量、SOC含量及团聚体稳定性均显著高于其他演替阶段（P＜0.05）。乔木林和乔灌混合林 0—30 cm平均 SOC 含量分别是 10.25 g·kg−1和 8.20 g·kg−1，分别为裸地的7.3倍和5.8倍；平均EE-GRSP含量分别是0.58 mg·g−1和0.61 mg·g−1（9.8倍和10.2倍），平均 T-GRSP 含量分别是 2.15 mg·g−1和 1.65 mg·g−1（27.6倍和21.2倍）；平均MWDFW分别是1.52 mm和1.53 mm（2.46倍和2.48倍）。说明演替阶段进行到乔木之后GRSP和SOC的累积加强，进一步提高了团聚体稳定性。

（2）EE-GRSP、T-GRSP和SOC与LB法3种破坏机制下MWD和＞0.25 mm团聚体占比均有极显著正相关关系（P＜0.01）。根据逐步回归结果，本研究中FW处理和SW处理下EE-GRSP对团聚体稳定性指标的解释效果最好，而在 WS处理下 TGRSP的解释效果更好。