柱前衍生化HPLC法测定柊叶游离氨基酸成分及风味评价

黄元河，黄玉镯，潘乔丹，*，陆海峰，黄 健

(1.右江民族医学院基础医学院，广西百色533000;2.右江民族医学院药学院，广西百色533000)

柊叶(Phrynium capitatum Willd.)别名粽叶，粽粑叶，为竹芋科多年生草本植物［1］，具有清热解毒、凉血止血的功效［2］，根茎用于治疗肝肿大、痢疾、赤尿，叶清热利尿功效，治音哑、喉痛、口腔溃疡，解酒毒等［1－2］。柊叶味道清甜，在我国广西、云南、贵州等地区少数民族常将其栽种于庭院，取叶裹米棕或包物用，能够提高粽子风味，改善糯米的黏腻，增强糯米益气健脾的功效。柊叶还具有防腐的功能，其叶包裹的粽子可保存数月，是有极大开发价值的粽子天然包装材料［3］。氨基酸是蛋白质的基本结构单位，是维持生命活动的物质基础，是人体的必需营养成分之一，对机体代谢具有非常重要的作用［4－5］。氨基酸还在食品的呈味方面扮演重要角色，这些氨基酸被称为呈味氨基酸，根据氨基酸的味觉感受，可以分为鲜味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸［6－9］。

目前氨基酸的分析方法有很多种，主要包括氨基酸自动分析仪［10］、高效液相色谱法［11］、毛细管电泳法［12］等，其中柱前衍生高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)法由于灵敏度高、重复性好，操作费用较低等优点，已经成为测定氨基酸的主要方法［13］。以异硫氰酸苯酯(PITC)作为衍生试剂，其产物单一稳定、易于检测，已成为一种常用的氨基酸衍生方法，已广泛用于检测蔬菜［14］、水果［15］、药材［16］等。

迄今为止有关柊叶中氨基酸含量分析的资料尚未见报道，因此本文建立一种柱前衍生高效液相色谱同时测定柊叶游离氨基酸的方法，测定氨基酸种类和含量，根据FAO/WHO理想模式为评定标准［17］评价其营养价值和呈味特性，为深入开发利用柊叶提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

柊叶6批次样品 都购置百色市右江区大菜市场不同商户，经右江民族医学院黄元河副教授鉴定为竹芋科植物柊叶(Phrynium capitatum Willd.)的叶。柊叶干燥箱60℃烘干后，粉碎处理，过60目筛，粉末4℃保存待用;三乙胺、乙腈、异硫氰酸苯酯 均为色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司;浓盐酸、无水乙酸钠、冰乙酸 均为分析纯，天津市西陇化工厂有限公司;超纯水 自制;18种氨基酸［天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、半光氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、赖氨酸(Lys)］纯度均大于98.0%，上海源叶生物科技有限公司。

LD－20ADIT型高效液相色谱仪、Shim－pack VP－ODS C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm)岛津企业管理中国有限公司;KQ2200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪有限公司;FA1104型电子天平 上海良平仪器仪表有限公司;TGL－15B型高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂;RE－3000型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;Mill－Q超纯水机 美国密理博。

1.2 实验方法

1.2.1 样品溶液制备与衍生化

1.2.1.1 样品溶液制备 精密称定柊叶粉末2.0 g，加入50%的乙醇溶液200 mL，超声(300 W，100kHz)取两次，每次30 min，抽滤去渣取合并滤液，滤液于旋转蒸发器80℃水浴挥至近干，用超纯水定容至10 mL，即得柊叶样品溶液［18］。

1.2.1.2 标准品溶液制备 分别称取Asp 22.0 mg、Glu 22.0 mg、Ser 12.0 mg、Gly 12.0 mg、His 22.0 mg、Arg 6.0 mg、Thr 12.0 mg、Ala 12.0 mg、Pro 12.0 mg、Tyr 11.0 mg、Val 11.0 mg、Met 11.0 mg、Cys 11.0 mg、Ile 12.0 mg、Leu 11.0 mg、Phe 12.0 mg、Trp 11.0 mg，Lys 12.0 mg、加0.1 mol/L盐酸溶液，置于50 mL容量瓶定容，即得氨基酸混合对照品储备液。

1.2.1.3 空白液制备 以0.1 mol/L盐酸溶液作为空白液。

1.2.1.4 衍生化处理 精密吸取样品溶液、标准品溶液和空白液，400μL置于1.5 mL离心管中，加入1 mol/L的衍生试剂A(1 mol/L三乙胺乙腈)200μL，衍生试剂B(0.1 mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液)200μL，混匀，室温避光放置1 h，加入正己烷800μL，混匀，12000 r/min离心5 min，取下层溶液，0.22μm滤膜过滤，超声5 min，即得衍生化溶液［19］。

1.2.2 色谱条件 采用Shim－Pack VP－ODS C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，流动相A为0.1%醋酸钠缓冲溶液(p H6.5)－乙腈(93∶7)，流动相B为乙腈－水(4∶1);梯度洗脱条件为0 min，0%B;11 min，7.0%B;13.9 min，12.0%B;14 min，15.0%B;29 min，34.0%B;32 min，50%B;37 min，100%B;50 min，0%B，流速1.0 mL/min，柱温40℃，检测波长254 nm时，18种氨基酸能有效分离，峰型理想;样品进样量为20μL［20］。

1.2.3 氨基酸营养价值与风味评价 氨基酸营养价值采用1973年FAO/WHO建议的氨基酸评分标准进行评价，评价指标包括必需氨基酸含量占总氨基酸含量的质量分数(EAA/TAA)、必需氨基酸含量占非必需氨基酸含量的质量分数(EAA/NEAA)和必需氨基酸的组分分析［17］。氨基酸的风味评价采用呈味氨基酸的含量和风味贡献强度，氨基酸风味贡献强度采用味觉阀值比(ratio of content and taste threshold，RCT)来评价，RCT=某风味氨基酸含量/相应氨基酸的味觉阀值［21］。

表1 18种氨基酸的线性回归方程Table 1 The linearity relationships of 18 amino acids

1.3 数据处理

全部实验数据用WPS Office表格进行统计处理，数值以均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 线性关系考察

精密吸取混合对照品储备液0.5、1.0、2.0、2.5、3.5、4.5 mL，分别置于5 mL量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液定容至刻度，精密吸取上述系列溶液各400μL于1.5 mL离心管中，制备衍生化溶液。按照色谱条件进样分析。分别以氨基酸质量浓度X(μg/mL)为横坐标，相应的峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。18种氨基酸的线性方程、线性范围、决定系数R2、检出限和定量限见表1，色谱图见图1。

图1 柊叶氨基酸高效液相色谱图Fig.1 Phrynium capitatum Willd.amino acid HPLC

由表1可知，18种氨基酸线性方程线性范围在0.307～440.0μmol/L，R2都在0.9990以上，结果良好。图1显示经过衍生化处理后，在该色谱条件下，18种氨基酸峰型良好，分离清晰。

2.2 稳定性、精密度和重复性实验

参考赵岩等［18］方法，稳定性实验取柊叶供试品衍生化溶液，分别于0、2、4、8、12、16、20、24 h进样，测定各氨基酸的峰面积计算标准差(RSD，relative standard deviation);精密度实验取衍生化标准品溶液，按色谱条件，连续进样6次，测定峰面积。结果18种氨基酸的峰面积RSD;重复性实验取同一批柊叶6份，进行衍生化处理，按色谱条件，进样分析，计算18种氨基酸含量，分析18种游离氨基酸百分含量RSD值，结果见表2。

由表2可知，在不同时间进样，18种氨基酸峰面积的RSD(n=8)在0.78%～3.0%，表明供试品溶液在室温放置24 h内基本稳定;连续进样6次，结果显示18种氨基酸的峰面积RSD(n=6)在0.18%～2.4%之间，表示仪器的精密度良好;同一批柊叶6份18种氨基酸含量百分含量RSD(n=6)在0.59%～2.3%之间，表明该方法重复性良好。

2.3 回收实验

取柊叶供试品溶液和标准品溶液按1∶4比例取样400μL，进行衍生化处理、进样分析，平行测定6次，分别计算各氨基酸含量的回收率和RSD。18种游离氨基酸的回收率平均在98.3%～105.6%之间，RSD在0.63%～3.11%之间，各种氨基酸的回收率都在98%以上，说明该测定方法较好，结果见表3。

2.4 氨基酸营养价值与风味评价

2.4.1 氨基酸营养评价 取6批次柊叶样品，制备衍生化溶液，进样测定18种类氨基酸含量。采用FAO/WHO的模式标准对柊叶游离氨基酸营养价值进行评价。柊叶游离氨基酸含量见表4和表5，色谱图见图1。

表2 稳定性、精密度和重复性实验的RSD值(%)Table 2 RSD values of stability，precision and repeatability experiments(%)

由表4可知，柊叶含有18种游离氨基酸和8种人体必需氨基酸。根据FAO/WHO的模式标准，质量较好的蛋白质氨基酸组成中EAA/TAA应在40.0%左右，EAA/NEAA应该在60.0%以上［9］。根据分析柊叶样品，EAA/TAA为38.85%左右，EAA/NEAA为61.15%以上，基本达到了FAO/WHO模式标准的要求。

表5显示，柊叶Leu和Lys的组分分别为2.9%和2.4%，低于WHO/FAO氨基酸模式谱外，其余氨基酸组分均高于WHO/FAO标准模式;所有必需氨基酸组分同时达到WHO/FAO氨基酸成人模式的需求，这说明柊叶必需氨基酸含量配比较为合理，营养较全面，是较好的植物蛋白。

2.4.2 风味评价氨基酸 除了营养作用之外，对食物口感和品质方面起到重要作用。这些呈味氨基酸依据其的味觉强度，大致可分为鲜味氨基酸(Asp、Glu、Lys)、甜味氨基酸(Thr、)、Ser、Gly、Ala、His、Pro)、苦味氨基酸(Val、Met、Ile、Leu、Arg)和芳香族氨基酸(Cys、Tyr、Phe)苦味氨基酸四大类［22］，这些呈味氨基酸在食品体系中的风味作用取决于各类氨基酸的含量和贡献度(RCT)，当RCT＜1时，表示该物质对风味无贡献，RCT≥1时，对风味有贡献［21］。6批次柊叶各种呈味氨基酸的含量以及RCT见表6。

表6可以看出，柊叶中含有17种呈味氨基酸，总含量为23.03 mg/g。其中鲜味氨基酸Asp含量最高，甜味氨基酸Thr其次，芳香族氨基酸Cys最低。各类呈味氨基酸含量中，鲜味氨基含量为5.20 mg/g，占呈味氨基酸总含量22.58%;甜味氨基酸含量为10.73 mg/g，占46.59%，苦味氨基 酸4.47 mg/g，占19.41%。3种鲜味氨基酸的RCT均＞1，其中Asp的RCT=125.00，对鲜味贡献度最大;6种甜味氨基酸中除了Gly的＜1，其余氨基酸的RCT均＞1，其中His和Ala的RCT分别为2.30和1.85，对甜味的贡献度较大;5种苦味氨基酸中，除了Leu对的RCT＜1，其它氨基酸RCT均＞1，其中Arg贡献度最大;芳香族氨基酸Tyr和Phe的RCT均＜1较大，而Cys的RCT=20.50，对香味的贡献度最大。综合分析，柊叶中鲜味氨基酸和甜味氨基酸含量大，鲜味氨基酸、甜味氨基酸和芳香族氨基酸对风味贡献度高。

表4 柊叶中游离氨基酸的含量测定结果(n=6，干样品)Table 4 Results of the determination of free amino acids in Phrynium capitatum(n=6，dry sample)

表5 柊叶各种必需氨基酸的组分分析Table 5 Composition and comparative analysis of essential amino acids in Phrynium capitatum(%)

表6 柊叶呈味氨基酸含量和组分分析Table 6 Analysis the content and constituent of flavor amino acid in Phrynium capitatum

3 结论

本研究采用柱前衍生化HPLC法测定柊叶游离氨基酸含量，色谱图显示在本色谱条件下18种氨基酸分离良好，基线分离。方法学考察结果显示，该方法简单易于操作，且稳定性和重复性良好。氨基酸营养组分分析显示，柊叶含有8种人体必需氨基酸，EAA/TAA为38.85%，EAA/NEAA都在60%以上，各种必需氨基酸组分达到WHO/FAO氨基酸成人模式的需求;这说明柊叶氨基酸含量配比较为合理，营养较全面，是较好的植物蛋白。风味分析显示，鲜味氨基酸和甜味氨基酸分别为10.73和5.20 mg/g，占呈味氨基酸总含量22.58%和46.59%，其中鲜味氨基酸Asp和甜味氨基酸Thr含量较高，分别为3.75和3.33 mg/g，鲜味氨基酸Asp和芳香族氨基酸Cys的RCT值最高分别为125.00和20.50，对风味贡献最高，可以选择鲜味氨基酸Asp和Glu，甜味氨基酸His和Ala，以及芳香族氨基酸Cys作为其产品质量标准。总之柊叶氨基酸种类齐全，比例合理，呈味氨基酸含量丰富，具有极大开发价值。