响应面优化紫果西番莲叶多酚超声辅助提取工艺及其抗氧化活性

贺银菊，张旋俊，杨再波，彭莘媚，卯申发

(1.黔南民族师范学院化学化工学院，贵州都匀558000;2.贵州省高校民族药用植物资源开发工程研究中心，贵州都匀558000)

西番莲(Passionfruit)又称百香果、鸡蛋果、巴西果，是西番莲科多年木质藤本植物，西番莲主要有黄果、紫果、紫红色果三个品种，其果实气味芳香浓郁，有“果汁之王”的美誉［1］。西番莲果实、种籽、果皮、茎、叶中均含有多种活性成分［2］，具有抗氧化［3］、抗菌［4］、抗炎［5］、抗抑郁［6］、抗疲劳［7］、降血压［8］等生物活性。研究发现，西番莲叶有抑菌、抗焦虑、保护神经等功效，其主要活性成分为三萜类、黄酮类、生物碱、酚类等物质［2］。在南美洲及欧洲的民间，西番莲叶被当作药物，用于治疗神经紧张、偏头痛、酒精中毒等疾病［9］。目前国内对西番莲的研究主要集中在果实中果汁、果皮及种子中的化学物质［10］，对西番莲叶的应用研究较少。

植物多酚具有抗菌［11］、抗病毒［12］、抗氧化［13］、降血脂［14］、抗肿瘤［15］、抗癌［16］及增强免疫力［17］等多种药理活性，其分离提取工艺研究备受关注。传统的提取多酚方法有煎煮法［18］、渗漉法［19］、有机溶剂法［20］等，近年来借助微波辅助［21］、超声辅助［22］、酶辅助［23］及超临界流体萃取［24］等方法提取多酚的应用越来越多，其中超声辅助法是利用超声波产生的空化效应和搅拌作用，破坏植物细胞，使溶剂渗透到植物细胞中去，可缩短提取时间、提高提取率。

查询文献发现目前国内外对西番莲叶中活性成分提取的报道较少，主要报道了其黄酮的提取及抗氧化活性［25］，对西番莲叶中多酚提取的文献未见报道。为研究西番莲叶中多酚提取量，本文以紫果西番莲叶为对象，借助超声辅助法优化其多酚的提取工艺，在单因素实验结果基础上通过Box－Behnken设计－响应面考察液料比、提取时间、超声功率和超声温度对紫果西番莲叶多酚提取量的影响，采用酒石酸亚铁法测定其多酚提取量，并以清除DPPH自由基和·OH能力评价其抗氧化活性，期望为进一步开发紫果西番莲的附加价值提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫果西番莲叶 紫果西番莲采于贵州省平塘县塘边镇新街村，洗净烘干，粉碎机打碎后过60目筛备用;没食子酸标准品(＞98%)合肥博美生物科技有限公司;DPPH(＞99%)、邻二氮菲(＞99%)上海阿拉丁生化科技股份有限公司;维生素C(AR)、酒石酸钾钠(AR)天津福晨化学试剂有限公司;硫酸亚铁(AR)西陇化工化学试剂;磷酸氢二钠(AR)、磷酸二氢钾(AR)、无水乙醇(AR)重庆川东化工。

粉碎机 浙江金华武义屹立仪器公司;DZ－2A型真空干燥箱、SHZ－D型循环水真空泵 郑州英峪予华仪器有限公司;TP－A200型电子天平 上海诺萱科学仪器有限公司;FA2204型电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司;KQ－500DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;UV－1800型双光束紫外可见分光光度计 上海美析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 紫果西番莲叶多酚提取 称取1.0 g紫果西番莲叶粉末于锥形瓶中，以95%乙醇溶液为提取溶剂，按照一定液料比、提取时间、超声功率和超声温度进行提取，提取完成后滤液转入50 mL容量瓶定容，得样品溶液，备用。

1.2.2 紫果西番莲叶多酚的测定

1.2.2.1 没食子酸标准曲线的建立 没食子酸标准溶液:称取没食子酸标准品100 mg，加蒸馏水溶解后转入100 mL容量瓶定容，得1.0 mg/mL没食子酸标准溶液备用。酒石酸亚铁溶液、p H=7.5的缓冲溶液按照GB/T 21733－2008配制［26］。

采用酒石酸亚铁法:分别移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的1.0 mg/mL没食子酸标准溶液，置于10 mL容量瓶中，补水至1 mL，加入酒石酸亚铁溶液3.0 mL，摇匀后以pH为7.5的磷酸盐缓冲溶液定容混匀，在540 nm处测定其吸光度。以浓度C(μg/mL)为横坐标、吸光度值A为纵坐标绘制标准曲线，得线性回归方程:y=0.01243x+0.02677，R2=0.99989。结果表明:在浓度为10～50μg/mL范围内吸光度与浓度呈良好的线性关系。

1.2.2.2 紫果西番莲叶多酚提取 按照1.2.1中紫果西番莲叶多酚提取的方法，将样品溶液稀释50倍后即得待测液，取1 mL待测液于10 mL容量瓶中，按照1.2.1的方法测定待测液浓度，按照下式计算紫果西番莲叶多酚提取量(Y):

Y(mg/g)=C×V×N/m×10－3

式中:C为待测液浓度，μg/mL;V为样品溶液的体积，mL;N为总稀释倍数;m为紫果西番莲叶的质量，g。

1.2.3 单因素实验 按照1.2.1中的提取方法，试验基本条件定为:液料比25∶1 mL/g，提取时间40 min，超声功率300 W和超声温度60℃。单因素实验条件为液料比(5∶1、15∶1、25∶1、35∶1、45∶1 mL/g)、提取时间(20、30、40、50、60 min)、超声功率(200、250、300、350、400 W)和超声温度(40、50、60、70、80℃)，分别考察液料比、提取时间、超声功率和超声温度对紫果西番莲叶多酚提取的影响。

1.2.4 响应面优化设计试验 根据单因素实验的结果和Box－Benhnken的中心组合设计试验因素和水平见表1。根据响应面优化设计试验结果进行验证性试验，并计算多酚提取量。

表1 响应面分析试验因素水平表Table 1 Levels and factors table of response surface methodology

1.2.5 紫果西番莲叶多酚抗氧化活性测定

1.2.5.1 清除DPPH自由基活性 参照贺银菊等［27］方法:取2.0 mL DPPH溶液和2.0 mL不同浓度(浓度依次为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mL)的样品溶液于10 mL比色管中，放置30 min，以蒸馏水做参比，在517 nm处测定其吸光度为A0，按照同样的方法测定2.0 mL 80%乙醇溶液和不同浓度多酚样品液2.0 mL的吸光度为A1，2.0 mL 80%乙醇溶液和2.0 mL DPPH溶液的吸光度为A2。以维生素C为对照品，DPPH自由基清除率计算公式:

清除率(%)=［1－(A0－A1)/A2］×100

1.2.5.2 清除·OH活性 参照贺银菊等［27］方法:取1.5 mL 5 mmol/L的邻二氮菲溶液于10 mL比色管中，加2.0 mL pH=7.5的磷酸盐缓冲液，再加1.0 mL 7.5 mmol/L的FeSO4溶液，蒸馏水定容，在37℃的水浴保温1 h，在510 nm处测定吸光度得A0;取1.5 mL 5 mmol/L的邻二氮菲溶液于10 mL比色管中，加2.0 mL pH=7.5的 磷 酸 盐 缓 冲 液，再 加1.0 mL 7.5 mmol/L的FeSO4溶液，加入1.0 mL 1.0 mL/L的H2O2，蒸馏水定容，在37℃的水浴保温1 h，在510 nm处测定吸光度得A1;取1.5 mL 5 mmol/L的邻二氮菲溶液于10 mL比色管中，加2.0 m L p H=7.5的磷酸盐缓冲液，再加1.0 mL 7.5 mmol/L的FeSO4溶液，分别加入0.1 mL不同浓度(浓度依次为0.05、0.10、0.15、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL)的样品溶液，再加1.0 mL 1.0 mL/L的H2O2，蒸馏水定容，37℃水浴保温1 h，在510 nm处测定吸光度得A2。以维生素C为对照品，按下式计算·OH清除率:

清除率(%)=(A0－A2)/(A0－A1)×100

1.3 数据处理

单因素实验及抗氧化活性数据采用Origin 8.0软件分析;响应面优化试验采用Design－Expert V8.0.6软件分析结果及方差，并进行模型分析优化提取工艺。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 液料比对紫果西番莲叶多酚提取量的影响 液料比对紫果西番莲叶中多酚提取量的影响见图1。由图1可知，随着液料比的增加，紫果西番莲叶中多酚提取量升高;当液料比为35∶1 mL/g时，紫果西番莲叶中多酚提取量最高，此时多酚提取量为13.31 mg/g。这是因为当液料比较小时，溶液粘稠度高，不利于多酚在溶剂中的扩散，多酚溶出量少，随着液料比的增大，溶液粘稠度降低，多酚在溶剂中扩散快，多酚溶出量多，到达35∶1 mL/g时，多酚已基本溶出。当液料比超过35∶1 mL/g，随着液料比的增大，紫果西番莲叶中多酚提取率反而下降，这是因为多酚已溶出完全，再增加溶剂用量杂质，杂质溶出增多抑制多酚溶出，多酚的浓度反而降低，因此较优液料比为35∶1 mL/g。

图1 液料比对紫果西番莲叶多酚提取量的影响Fig.1 Effect of solvent to material ratio on extraction amount of polyphenols from the purple passionfruit leaves

2.1.2 提取时间对紫果西番莲叶多酚提取量的影响 提取时间对紫果西番莲叶中多酚提取量的影响见图2。由图2可知，随着提取时间的增加，紫果西番莲叶中多酚提取量升高;当提取时间为50 min时，紫果西番莲叶中多酚提取量最高，此时多酚提取量为12.90 mg/g。这是因为随着时间的增加，多酚溶出量增加，提取时间为50 min时，多酚已基本溶出;再延长提取时间对提取量贡献不大，反而使多酚在机械波和热效应的影响下不稳定，被分解或氧化成其他物质［28］，使多酚提取量降低，因此较优提取时间为50 min。

图2 提取时间对紫果西番莲叶多酚提取量的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction amount of polyphenols from the purple passionfruit leaves

2.1.3 超声功率对紫果西番莲叶多酚提取量的影响 超声功率对紫果西番莲叶中多酚提取量的影响见图3。由图3可知，随着超声功率的增加，紫果西番莲叶中多酚提取量升高;当超声功率为350 W时，紫果西番莲叶中多酚提取量最高，此时多酚提取量为12.84 mg/g。这是因为超声功率增强后，超声波的振荡增强，超声波破坏样品细胞壁后溶剂进入固体样品内部，多酚溶出量增加，当超声功率为350 W时，多酚已基本溶出，再增加超声功率紫果西番莲叶中多酚提取量反而降低，这是因为多酚结构被破坏，同时溶出的杂质也增多，使多酚提取量反而降低，因此较优超声功率为350 W。

图3 超声功率对紫果西番莲叶多酚提取量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on extraction amount of polyphenols from the purple passionfruit leaves

2.1.4 超声温度对紫果西番莲叶多酚提取量的影响 超声温度对紫果西番莲叶中多酚提取量的影响见图4。由图4可见，随着超声温度的升高，紫果西番莲叶中多酚提取量升高，当超声温度为70℃时紫果西番莲叶中多酚提取量最高，此时多酚提取量为13.11 mg/g。这是因为随着温度的升高，分子运动增强，液固接触机率增多，多酚溶出增加;当超声温度为70℃时，多酚已基本溶出，再升高超声温度，会因为温度过高，使溶剂易变为蒸汽，实际参与提取的溶剂量减少，同时温度过高导致多酚分解和氧化，因此多酚提取反而降低，因此较优超声温度为70℃。

图4 超声温度对紫果西番莲叶多酚提取量的影响Fig.4 Effect of temperature on extraction amount of polyphenols from the purple passionfruit leaves

2.2 响应面试验优化

2.2.1 响应面试验设计及结果 根据Box－Benhnken的中心组合原理设计了29组试验，试验结果见表2。用Design－Expert V8.0.6进行分析与拟合后，得紫果西番莲叶多酚提取量(Y)的回归方程:

Y(mg/g)=13.11+0.47A+1.10B+0.15C+0.058D－0.20AB－0.035AC－0.13AD+0.002.500BC－0.025BD+0.000CD－0.98A2－1.26B2－1.06C2－1.08D2。

响应面分析模型的方差分析见表3。由表3可知，模型的P值小于0.0001，说明试验二次模型拟合度较高，可正确反映各提取因素与响应值之间的变化关系。模型的决定系数、校正确定系数分别为R2=0.9896和，变异系数CV=1.50%较小，失拟项P值为0.7414大于0.05，说明模型拟合好、稳定、可靠。因素A、B、C、A2、B2、C2、D2对紫果西番莲叶多酚提取量影响极显著(P＜0.01)，交互项AB对紫果西番莲叶多酚提取量影响显著(0.01＜P＜0.05)，因素D及交互项AC、AD、BC、BD、CD对紫果西番莲叶多酚提取量没有显著性影响(P＞0.05)。由表3模型的方差分析可得出4个因素对紫果西番莲叶多酚提取量影响顺序为提取时间(B)＞液料比(A)＞超声功率(C)＞超声温度(D)。

两两因素交互作用响应面见图5，由图5可知:各因素交互作用响应面开口均向下，说明响应面值均随每个因素增大而增大，达到峰值后又逐渐减小。响应面坡面越陡峭，则紫果西番莲叶多酚提取量受试验因素影响就越大，反之响应面坡面越平缓，紫果西番莲叶多酚提取量受试验因素影响就越小。图中响应面坡面陡峭顺序为AB＞AD＞AC＞BD＞BC＞CD，即液料比和提取时间交互作用响应面最陡峭，表明液料比和提取时间的交互作用对紫果西番莲叶多酚提取量影响显著，从等高线看液料比对多酚提取影响较大;而超声功率和超声温度交互作用响应面最平缓，表明超声功率和超声温度的交互作用对紫果西番莲叶多酚提取量影响不显著，从等高线看超声温度对多酚提取的影响较小。

2.2.2 响应面试验优化及验证试验 经Design－Expert V8.0.6软件模型分析，预测紫果西番莲叶多酚最佳提取工艺为:液料比35.97∶1 mL/g、提取时间54.19 min、超声功率353.31 W和超声温度70.10℃，此时理论多酚提取量为13.3895 mg/g。根据实际操作设计紫果西番莲叶中多酚提取条件为:液料比36∶1 mL/g、提取时间54 min、超声功率350 W和超声温度70℃，按此工艺进行3次平行试验，测得紫果西番莲叶的平均多酚提取量为(13.19±0.17)mg/g，结果与预测的理论相近。表明模型拟合良好，参数准确可靠。

表2 响应面设计试验结果Table 2 Arrangement and results of response surface methodology

2.3 紫果西番莲叶多酚抗氧化活性

2.3.1 清除DPPH自由基活性 紫果西番莲叶多酚对DPPH自由基的清除活性如图6所示。由图6可知，紫果西番莲叶多酚具有一定的DPPH自由基清除能力。多酚对DPPH自由基清除率先随着样品浓度的增加而增大，浓度与活性呈现一定的量效关系，当浓度为0.2 mg/mL后，多酚对DPPH自由基清除率达82.25%，但明显低于对照品维生素C的清除活性(95.41%)，经Origin 8.0软件拟合，紫果西番莲叶多酚对DPPH自由基的半抑制浓度(IC50)为0.058 mg/mL，对照品维生素C的半抑制浓度(IC50)为0.007 mg/mL。段宙位等［29］研究了沉香叶多酚类化合物清除DPPH自由基的半抑制浓度(IC50)为0.106 mg/mL，表明紫果西番莲叶多酚有较好的清除DPPH自由基能力。

表3 模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of model

图5 各因素两两交互作用的对紫果西番莲叶多酚提取量的响应面Fig.5 Response surface of the effect interaction between two factors of the extraction amount of polyphenols from the purple passionfruit leaves

图6 紫果西番莲叶多酚对DPPH自由基清除作用Fig.6 DPPH radicals scavenging activity of polyphenols from the purple passionfruit leaves

2.3.2 清除·OH活性 紫果西番莲叶多酚对·OH的清除活性如图7所示。由图可知，紫果西番莲叶多酚具有一定的·OH的清除能力:多酚对·OH清除率先随着样品浓度的增加而增大，浓度与活性呈现一定的量效关系，当浓度低于0.8 mg/mL时，多酚对·OH清除率高于对照品维生素C;当浓度为0.8 mg/mL时，多酚对·OH清除率达90.59%，与对照品维生素C的清除活性(90.89%)相当，经Origin 8.0软件拟合，紫果西番莲叶多酚对·OH的半抑制浓度(IC50)为0.144 mg/mL，对照品维生素C的半抑制浓度(IC50)为0.282 mg/mL。李南薇等［30］等研究了木瓜叶多酚清除·OH的半抑制浓度(IC50)为0.440 mg/mL，表明紫果西番莲叶多酚有较好的清除·OH能力。

图7 紫果西番莲叶多酚对·OH清除作用Fig.7 Hydroxyl radicals scavenging activity of polyphenols from the purple passionfruit leaves

3 结论

采用超声辅助提取其多酚，在单因素实验的基础上结合响应面优化其提取工艺。结果表明:响应面分析的二次模型是极显著的，准确性较高，液料比(A)、提取时间(B)、超声功率(C)及超声温度(D)等4个因素对多酚提取量影响顺序为提取时间(B)＞液料比(A)＞超声功率(C)＞超声温度(D)，其多酚提取最佳工艺:液液料比36∶1 mL/g、提取时间54 min、超声功率350 W和超声温度70℃，此时紫果西番莲叶多酚的提取量为(13.19±0.17)mg/g。并以清除DPPH自由基和·OH能力评价了紫果西番莲叶多酚的抗氧化活性，其清除DPPH自由基、·OH的半抑制浓度(IC50)分别为0.058、0.144 mg/mL，表明紫果西番莲叶多酚具有较好抗氧化活性，可作为潜在的天然抗氧化剂的来源应用于食品、医药等领域。