超声波辅助酶法提取琯溪柚皮海绵层水溶性抗氧化膳食纤维工艺优化

薛 山，肖 夏，谢建山

(1.闽南师范大学生物科学与技术学院，福建漳州363000;2.菌物产业福建省高校工程研究中心，福建漳州363000;3.四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000)

膳食纤维(dietary fiber，DF)凭借其特殊的结构组成和生理功效得到了学术界的广泛关注［1］。1998年，Saura－Calixto［2］提出了一个新概念——抗氧化膳食纤维(antioxidant dietary fiber，ADF)，即大量天然抗氧化剂结合到DF基质中的产物。ADF按水中溶解性的不同分为水溶性膳食纤维(Soluble antioxidant dietary fiber，SADF)和非水溶性膳食纤维(Insoluble antioxidant dietary fiber，IADF)，SADF中富含黄酮类、酚酸以及缩合单宁等天然抗氧化成分［3－4］。在前期研究中，本团队已证实植物性膳食纤维具有明显的抗氧化活性，并且已广泛应用于食品保鲜与功能食品研发等领域［5－7］。

琯 溪 蜜 柚(Citrus maxima(Burm.)Merr.cv.Guanximiyou)是享誉中外的我国特有的优良柚类品种，也是漳州平和地区的地标性水果，具有果大、汁多、口感酸甜等优良品性［8］。福建省平和县琯溪蜜柚年产量达到180余万t，总产值(超过20亿元)占全县农业总产值的40%以上［9］。近年来，柚类水果种植面积和产量不断增长带动了柚子加工业的快速发展。在柚子加工过程中，形成了大量的副产物，其中，占柚子鲜重16%～32%左右的柚皮是最主要的副产物［10－11］。琯溪蜜柚柚皮海绵层中富含水分、纤维素、木质素和多种生理活性成分，如果能作为功能原料被综合利用，既可以减少资源浪费，也可以保护环境。

柚皮的综合利用已成为国内外研究的热点，但有关柚皮海绵层ADF的研究尚未有见报道。张荔菲等［3］研究认为，柚皮DF传统提取方法(如热水浸提法、碱提法)效率低且成本高，而超声波、酶解等辅助提取法具有良好的效果，这是因为超声波能在液体中高频振动并产生空化效应，破坏细胞组织结构，有助于多糖的溶出和扩散;酶则可使植物细胞壁及细胞膜中的成分有效分解，从而提高提取率。因此，本研究采用Box－Benhnken设计与Matlab分析法，基于SADF的得率与抗氧化性，优化超声波辅助酶法提取琯溪蜜柚柚皮海绵层的SADF，拟为蜜柚的综合利用提供理论依据，为蜜柚产业的发展提供动力。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜的平和琯溪蜜柚柚皮 采收于九月下旬漳州柚之乡食品有限公司提供;水杨酸、无水乙醇、七水合硫酸亚铁、30%过氧化氢、硫酸、苯酚、十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠 以上试剂均为分析纯，购于西陇科技股份有限公司;纤维素酶(50 U/mg)河南亚统食品原料有限公司。

DGG－9140B电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司;FW100高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;AR124CN电子天平 奥豪斯仪器(上海)有限公司;US6180D超声波发生器 北京优晟联合科技有限公司;HH－2数显电子恒温水浴锅 常州国华电器有限公司;UV5100B紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;STARTER 2100 pH计 奥豪斯仪器(上海)有限公司;SHZ－D(III)循环水式多用真空泵 河南省予华仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 将新鲜的柚子皮去除表面黄油胞层，剩余的海绵层切成0.2 cm薄片，于60℃鼓风烘干至恒重，之后粉碎过40目筛，得到海绵层柚皮粉，密封置于干燥器中备用。

1.2.2 柚皮SADF的提取工艺 参考吴笑臣等［12］方法略微修改。称取柚皮粉5.0 g(m1)，按料液比1∶40 g/mL加入p H6.0(0.2 mol/L)的PBS缓冲溶液，均质后于常温超声功率180 W的条件下超声处理30 min。向混合体系加入2.5%的纤维素酶溶液(称取25 mg的纤维素酶，溶解1 mL pH6.0的柠檬酸缓冲液中)，45℃水浴80 min。酶解结束之后，冷却至室温，于8000 r/min离心10 min，收集上清液。将上清液65℃真空度－0.098 MPa旋蒸浓缩至原体积的1/3，转入烧杯中，加入4倍体积的无水乙醇，室温中静置醇沉12 h，过滤后洗涤冻干得到SADF(m2)。SADF的得率按下试计算:

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 超声波作用时间对柚皮SADF得率和羟自由基清除率的影响 设定料液比1∶40 g/mL，纤维素酶溶液添加量2.5%，纤维素酶作用温度45℃，纤维素酶作用时间80 min，考察不同超声波作用时间10、20、30、40、50 min对柚皮SADF得率和羟自由基清除率的影响。

1.2.3.2 料液比对柚皮SADF得率和羟自由基清除率的影响 设定超声波作用时间30 min，纤维素酶溶液添加量2.5%，纤维素酶作用温度45℃，纤维素酶作用时间80 min，考察不同料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL对柚皮SADF得率和羟自由基清除率的影响。

1.2.3.3 纤维素酶添加量对柚皮SADF得率和羟自由基清除率的影响 设定超声波作用时间30 min，料液比1∶50 g/mL，纤维素酶作用温度45℃，纤维素酶作用时间80 min，考察不同纤维素酶添加量1.5%、2.0%、2.5%、3%、3.5%对柚皮SADF得率和羟自由基清除率的影响。

1.2.3.4 纤维素酶解温度对柚皮SADF得率和羟自由基清除率的影响 设定超声波作用时间30 min，料液比1∶50 g/mL，纤维素酶添加量3%，纤维素酶作用时间80 min，考察不同纤维素酶作用温度25、35、45、55、65℃对柚皮SADF得率和羟自由基清除率的影响。

1.2.3.5 纤维素酶作用时间对柚皮SADF得率和羟自由基清除率的影响 设定超声波作用时间30 min，料液比1∶50 g/mL，纤维素酶添加量3%，纤维素酶作用温度45℃，考察不同纤维素酶作用时间40、60、80、100、120 min对柚皮SADF得率和羟自由基清除率的影响。

1.2.4 Box－Benhnken法试验优化 在单因素实验的基础上，选择对实验结果影响最为显著的三个因素料液比(A)、纤维素酶作用温度(B)和纤维素酶作用时间(C)，以柚皮海绵层SADF得率和羟自由基清除率，根据Box－Behnken的中心组合试验设计原理，建立3因素3水平的组合试验进行优化。因素和水平见表1。

表1 响应面试验因素水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.5 柚皮SADF抗氧化性的测定 参考Yu等［13］方法修改为:准确称取0.30 g SADF，定容至100 mL制得样品液。在10 mL比色试管中依次加入4.5 mmol/L的FeSO4溶液1.00 mL、4.5 mmol/L的水杨酸溶液1.00 mL、样品液0.50 mL，4.4 mmol/L的H2O2溶液1.00 mL，用去离子水水定容至10 mL，摇匀，置于37℃恒温水浴中处理30 min，在510 nm处测其吸光度，重复实验，取平均值Ai;另用去离子水代替H2O2溶液重复上述试验，测得参比吸光度Aj;用去离子水代替样品溶液重复上述试验，测得空白吸光度A0。羟自由基清除率用下式计算:

1.2.6 Matlab分析法 利用Matlab软件，采用优化计算方法以及算法语言的图形处理功能，通过编制程序M(程序代码)，计算出料液比(A)，纤维素酶作用温度(B)，纤维素酶作用时间(C)对SADF得率(y1)和羟自由基清除率(y2)的四维及三维交互影响结果。

1.3 数据处理

所有数据均用3次平行实验的平均值表示，利用SPSS Statistics 24.0统计软件对试验数据进行单因素显著性分析，P＜0.05表示结果显著，标示为不同字母。利用Matlab(MATrix LA Boratory)软件进行交互试验数据计算及四维、三维绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 超声波作用时间对柚皮SADF得率和羟自由清除率的影响 超声波作用时间对柚皮SADF得率和羟自由基清除率的影响如图1所示。物料的数量和结构性质都会影响超声波提取的效果，长时间超声产生的强烈空化效应会导致大分子成分降解［14－15］。在超声波作用时间10～50 min范围内，SADF的得率整体稳步升高后降低，在30 min时得率取得最大值。不同超声波处理时间(10～30 min)所提SADF溶液(3 mg/mL)的羟自由基清除率随着超声时间的延长而显著升高(P＜0.05)，之后显著下降，其中30与40 min处理时间下所提SADF羟自由基清除率差异不显著(P＞0.05)。综合考虑SADF得率和羟自由基清除率，选择超声波作用时间30 min进行后续优化实验。

图1 超声波作用时间对柚皮SADF得率和羟自由基清除率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic time on extraction yield and antioxidant activity of SADF from spongy layer of pomelo peels

2.1.2 料液比对柚皮SADF得率和羟自由清除率的影响 如图2所示，随着料液比的升高，柚皮SADF的得率呈现先显著升高后下降的趋势(P＜0.05)，在料液比1∶40～1∶50 g/mL区间有较大值。在料液比1∶20～1∶60 g/mL范围内，SADF的羟自由基清除率呈现整体显著升高趋势。推测原因可能是因为，料液比的增大有利于提取反应的正向进行，当料液比增大到一定程度，酶促反应底物浓度大大下降，导致SADF提取受到了抑制，但同时较高的料液比可能使得反应体系中其他水溶性、且具有抗氧化性的物质溶出，故SADF的羟自由基清除率不降反而升高。在保证有较高得率的前提下，选择有较高羟自由基清除率的工艺条件，故选择料液比1∶50 g/mL进行后续的试验。

图2 料液比对柚皮SADF得率和羟自由基清除率的影响Fig.2 Effect of solid－liquid ratio on extraction yield and antioxidant activity of SADF from spongy layer of pomelo peels

2.1.3 纤维素酶添加量对柚皮SADF得率和羟自由清除率的影响 当底物浓度一定时，增大酶添加量可以提高反应的速度，从而提高得率;当酶浓度达到足以使反应迅速完成时，即为酶的最大加入量，此时的化学反应达到动态平衡;但是当酶添加量过大时，则会打破动态平衡而抑制反应的进行，从而使得率下降［16］。随着纤维素酶添加量的增加，柚皮SADF的得率和羟自由基清除率呈现整体升高的趋势(P＜0.05)。纤维素酶添加量在2.5%～3.5%范围内有较高得率，在3.0%添加量时羟自由基清除率最高，故纤维素酶添加量选择3.0%。推测其原因，纤维素酶的添加可使柚皮中部分IADF发生降解，大分子链被切断，分子量降低，溶解度增大，且部分IADF也会转变成SADF，使得得率升高，同时，生成的SADF也具有一定的抗氧化活性，故羟自由基清除能力也显著升高;当酶添加量继续增加，IADF会降解为分子质量更小的低聚糖甚至单糖，聚合度低且无法被醇沉，从而使SADF得率降低，提取物的羟自由基清除能力也有所减弱［12］。

图3 纤维素酶添加量对柚皮SADF得率和羟自由基清除率的影响Fig.3 Effect of cellulase addition on extraction yield and antioxidant activity of SADF from spongy layer of pomelopeels

2.1.4 纤维素酶作用温度对柚皮SADF得率和羟自由清除率的影响 加热温度能够显著影响纤维素酶的活力，温度过高，酶会失活，温度过低，酶的活力会下降［16］。如图4所示，随着纤维素酶作用温度的升高，柚皮SADF的得率及羟自由基清除率均呈现先显著升高后降低的趋势(P＜0.05)。SADF得率在水浴45℃时有最大值，不同酶作用温度条件下所提SADF(3 mg/mL)羟自由基清除率在45～65℃区间有较大值，且数据差异不显著(P＞0.05)。因此，纤维素酶作用温度选择45℃。

图4 纤维素酶作用温度对柚皮SADF得率和羟自由基清除率的影响Fig.4 Effect of cellulase temperature on extraction yield and antioxidant activity of SADF from spongy layer of pomelopeels

2.1.5 纤维素酶作用时间对柚皮SADF得率和羟自由清除率的影响 纤维素酶作用时间对柚皮SADF得率和羟自由基清除率的影响如图5所示。随着纤维素酶作用时间的延长，SADF的得率在40～100 min加热过程中显著升高(P＜0.05)，其中，酶作用80和100 min条件下得率差异不显著(P＞0.05)，继续延长加热时间则得率显著下降(P＜0.05)。SADF的羟自由基清除率在测定时间内也呈现先升高后下降的趋势(P＜0.05)，在酶处理80 min后取得最大值。在保障有较高得率的前提下，选择有较高羟自由基清除率的工艺参数，故综合考虑选择纤维素酶作用时间80 min。

图5 纤维素酶作用时间对柚皮SADF得率和羟自由基清除率的影响Fig.5 Effect of cellulase action time on extraction yield and antioxidant activity of SADF from spongy layer of pomelopeels

2.2 Box－Benhnken优化柚皮SAD提取工艺实验结果

2.2.1 Box－Benhnken双响应面模型的建立 在单因素试验结果的基础上，确定了响应面试验的参数范围和工艺条件，根据Box－Behnken的中心组合试验设计原理，选取三个显著性影响较大的因素料液比(g/mL)、纤维素酶作用温度(℃)、纤维素酶作用时间(min)作为考察因素，分别以A、B、C表示，以柚皮SADF的得率(Y1)和羟自由基清除率(Y2)为响应值，建立3因素3水平的响应面优化实验，试验结果如表2所示。

采用Design－Expert 8.0.6软件对Box－Benhnken双响应面分析得出Y1和Y2的回归方程分别为:

表2 Box－Benhnken响应面优化试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface optimization of Box－Benhnken

2.2.2 Box－Benhnken响应模型的显著性检验 对回归模型进行方差分析，对模型系数进行显著性检验，结果见表3和表4。方程可靠性由R2表示，其统计学上的显著性由F值检验，影响因素的显著性由模型系数的P值检验。由表3和表4可知:模型P均小于0.01(极显著)，失拟项P均大于0.05(不显著)，表明该回归方程对试验的拟合度高，误差小。可以用该方程对不同条件下的提取效果进行分析、预测。通过F值可以得出，各因素对SADF提取量和羟自由基清除率的影响显著性大小均为:料液比(A)＞纤维素酶作用时间(C)＞纤维素酶作用温度(B)。

回归方程可行度分析结果见表5。R2值越接近1，说明回归方程越可靠，表明该回归方程可以描述该试验各因素与响应值的关系。SADF得率和羟自由基清除率的回归方程相关系数R2分别为0.95和0.93，说明回归方程的可靠性较好。值表明回归方程校正后可以解释的响应值变化，回归方程矫正决定系数分别为0.89和0.84，得率方程信噪比Adeq Precision为14.02，说明该模型可用于预测，但羟自由基清除率的方程Adeq Precision为0.905，可预测性较低。C.V.(%)值反映的是回归方程的置信度，值越小，说明回归方程的置信度越高。因此这两个回归方程都具有较高可信度。

2.2.3 Box－Benhnken双响应面最优工艺预测及验证 根据Box－Benhnken双响应面实验结果分析，得到最佳工艺参数的理论值为:料液比1∶55 g/mL、纤维素酶作用温度50℃和纤维素酶作用时间90 min，此时SADF提取量和羟自由基清除率的理论值分别为31.39%和63.98%，按照该工艺条件进行3组平行实验对其进行验证，得到得率和自由基清除率分别为32.82%±0.33%和64.43%±1.88%。

2.3 Matlab分析最优工艺区间

Matlab是国际上最优秀的科技应用软件之一，具有强大的科学计算功能，并提供了专门的优化工具箱，通过建立研究问题的数学模型，编写程序代码，有效计算出最优解，广泛应用于各研究领域［17］，如化工油脂提取优化［18］。Matlab可以通过编程得到某一影响因素(不同高、中、低)取值时对应的最优工艺取值范围，从而弥补Box－Benhnken设计仅得到具体最佳工艺参数取值的不足，因此，Matlab优化分析针对实际生产过程中工艺参数的波动性更具有参考价值。

表3 基于SADF得率的方差分析结果Table 3 The variance analysis result based on the extraction yield of SADF

表4 基于SADF羟自由基清除率的方差分析结果Table 4 The variance analysis result based on the hydroxyl radical scavenging rate of SADF

表5 回归方程的可行度Table 5 The feasibility of the regression equation

经过分析，得到料液比(g/mL)、纤维素酶作用时间(min)和纤维素酶作用温度对柚皮SADF得率和羟自由基清除率的四维效果图(图6、图7)。当SADF得率(y1)取得理论最大值(31.40%)时，通过矩阵计算得到料液比1∶55 g/mL，纤维素酶作用温度为49.18℃，纤维素酶作用时间90 min;同理，当SADF羟自由基清除率(y2)取得理论最大值(66.68%)时，料液比1∶55 g/mL，纤维素酶作用温度为40℃，酶作用时间为70 min。

图6 基于y1优化的四维交互曲面Fig.6 The 4－D interactive surface based on the optimizing of y1

为了更好地描述分析数据间的交互影响，分别绘制当纤维素酶作用时间短(70 min)、中(80 min)、长(90 min)时，料液比与纤维素酶作用温度对y1，y2交互影响的三维旋转曲面与等高线投影图(图8)。

图7 基于y2优化的四维交互曲面Fig.7 The 4－D interactive surface based on the optimizing of y2

当提取时间(C)取下限值(C=70 min)时，固定酶作用温度(B)，随着料液比(A)的升高，y1(实线)呈现逐渐升高的趋势，y2(虚线)在料液比高于1∶50 g/mL之后呈现显著升高的趋势;固定A值，随着B的升高，y1持续升高，y2则先降低后升高。此时，y1取值范围为20.71%～29.72%，y2取值范围为45.94%～66.68%。当料液比为1∶53～1∶55 mL/g，酶作用温度在44～50℃时，y1和y2可同时取得最大值。

当提取时间(C)取中间值(C=80 min)时，y1和y2的变化趋势与C=70℃时较为类似。固定B值，随着A值增大，y1先减小后增大，料液比越趋近1∶55 mL/g越可以取得最大值。固定A值，随着B值的增大，y2先减小，后增大，越趋向温度或者高温，反而越能够取得最大值，约在45℃左右取值较低。此时，y1取值范围为21.21%～28.86%，y2取值范围为47.80%～64.66%。当料液比大于1∶53.5 mL/g，酶作用温度约趋向50℃时，y1和y2可同时取得最大值。

当提取时间(C)取上限值(C=90 min)时，y1和y2的变化趋势与C=70 min和80 min时也较为类似。此时，y1取值范围为25.12%～31.40%，y2取值范围为51.50%～66.16%。当料液比大于1∶53 mL/g，酶作用温度48～50℃时，y1和y2可同时取得最大值。

图8 各因素交互作用对SADF提取量及自由基清除率影响的等高线图和响应面图Fig.8 Contour plots and response surface plots of the effects of the interaction of various factors on the extraction amount and radical scavenging rate of SADF

综上所述，当提取时间取上限值(C=90 min)时，y1可以取得较高理论值，当提取时间取下限值(C=70 min)时，y2可以取得理论较大值;当提取时间取较高值(C=90 min)，料液比越趋近1∶55 mL/g，纤维素酶作用温度越趋近50℃，y1和y2的值越趋近最大值。

3 结论

以漳州平和琯溪蜜柚柚皮为原料，采用Box－Behnken响应面结合Matlab分析法优化柚皮海绵层SADF超声波辅助酶法提取工艺。兼顾SADF得率与羟自由基清除率，得到最优提取工艺参数取值(范围)为:超声波前处理30 min，料液比1∶55 g/mL(1∶53～1∶55 g/mL)，纤维素酶添加量3%，纤维素酶作用温度50℃(48～50℃)，纤维素酶作用时间90 min(上限值C=90 min)。此时，柚皮SADF的得率与羟自由基清除率可分别达到32.82%±0.33%，64.43%±1.88%，模型显著可靠。Box－Benhnken响应面设计与Matlab分析相结合的优化方法，不仅能够准确得到最佳提取方案，也能够更直观的找出合理的工艺参数区间，为SADF工业化加工利用研究提供理论基础与创新依据。