山银花总三萜超声辅助提取工艺优化及其抗菌抗氧化活性研究

景炳年，魏 磊，周 雍，范 毅，刘雨晴，王学方，陈 飞，张华南，马艳妮，王 伟

(河南省生物技术开发中心/河南省植物天然产物开发工程技术研究中心，河南郑州450002)

山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand.－Mazz.)、红 腺 忍 冬(Lonicera hypoglauca Miq.)、华南忍冬(Lonicera confuse DC.)或黄 褐 毛 忍 冬(Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng)的干燥花蕾或带初开的花［1］，为常用大宗药材，药食兼用品种［2］。山银花因其较好的清热解毒、凉散风热之功效，一直被作为多种中成药的主要原料［3－4］。现代药理学研究表明，山银花具有抗炎［5－7］、抗菌［8－9］、抗病毒［10－13］、抗氧化［14－16］、抗动脉粥样硬化等作用［17］，近年来，山银花还被广泛应用于食品、饮料、保健品、化妆品和兽医用等方面［18］。因此，山银花具有非常巨大的市场开发潜力。

山银花富含挥发油、有机酸、皂苷类等多种活性成分，其中三萜皂苷类化合物是绿原酸之外的具有抗炎作用的有效成分［19］。山银花中三萜皂苷类成分主要为灰毡毛忍冬皂苷甲、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙和川续断皂苷Ⅵ等［20］。相关研究表明，山银花总皂苷对多种原因所致的肝毒性、肝损伤具有明显的保护作用［21－27］。此外，山银花总皂苷还具有抗炎［28］、抗食物过敏［29－31］的作用。

寻找一种高效、实用的提取工艺是山银花总皂苷作为有效部位进一步开发研究的重要环节。黄佳等［32］和缪艳燕等［33］分别以正交试验建立了乙醇回流提取山银花中灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙和煎煮法提取黄褐毛忍冬中α－常春藤皂苷的最佳提取工艺，张卫军等［34］利用正交设计法考察了微波辅助法提取黄褐毛忍冬总皂苷的工艺，这些研究多限于对α－常春藤皂苷等特定成分的提取，或以正交试验方法确定总皂苷最佳提取条件，但目前未见利用响应面法优化山银花总三萜超声提取工艺，并研究其抑菌和抗氧化活性的报道。本研究拟在前期单因素试验基础上，采用响应曲面方法(Response Surface Methodoloy，RSM)进一步综合分析比较影响超声波提取山银花总三萜的关键因素，确定最佳工艺参数;并对所提取的总三萜进行抑菌作用和抗氧化活性研究，以期为该植物资源的充分、合理开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山银花 购自河南郑州中草药批发市场，产地湖南，经河南中医药大学生药学专家董诚明教授鉴定为灰毡毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand.－Mazz.)的 干 燥 花 蕾;齐 墩 果 酸 标 准 品(批 号121213，纯度≥98%)成都普菲德生物技术有限公司;大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 25922、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 29213、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)ATCC 19615、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)ATCC 13311、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)ATCC 49619、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 27853、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC 700603 以上7株试验菌株冻干菌种购自南京便诊生物科技有限公司;粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、都柏林沙门氏菌(Salmonella dublin)以上3株试验菌株冻干菌种为河南省科学院天然产物重点试验室保存菌种;胰蛋白胨 上海宝录生物科技有限公司;牛肉浸膏 北京双旋微生物培养基制品厂;微量MIC测定板 美国Corning公司;无水乙醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸 均为分析纯，购自北京化工厂。

DHG－9055A型电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;ME－204型电子天平 美国Mettler公司;114摇摆式四两装高速中药粉碎机 瑞安市永历制药机械有限公司;KQ－500E型超声波清洗仪(功率500 W，频率40 k Hz)昆山市超声仪器有限公司;EYELA N－1100型旋转蒸发仪 上海爱郎仪器有限公司;SHB－III型水循环式真空泵 郑州长城科工贸有限公司;TU－1810型紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;YJ－VS－2型超净工作台 无锡一净净化设备有限公司;SYQ－DSX－280B型手提式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂;wi93008型麦氏比浊仪 北京东西仪科技有限公司;DHP－9082型电热恒温培养箱 上海红华仪器有限公司;XMTD－7000型恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 山银花粗粉的制备 将山银花置于50℃恒温干燥箱内烘干24 h后，使用高速中药粉碎机粉碎，过40目筛得到山银花粗粉。

1.2.2 山银花总三萜的提取工艺 精密称取山银花粗粉1.0 g，置于100 mL锥形瓶中，加溶剂超声辅助(40 kHz频率固定)提取，重复三次，滤液合并后浓缩，定容至50 mL容量瓶中，摇匀。精密吸取0.2 mL提取液置于10 mL容量瓶中，进行测定并计算山银花总三萜得率。平行3次，取平均值［35］。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 不同乙醇浓度对总三萜得率的影响 在料液比1∶20(g/mL)、超声温度50℃、超声时间60 min的条件下，乙醇浓度分别为20%、40%、60%、80%、100%时，以总三萜得率为考核指标，考察乙醇浓度对山银花总三萜得率的影响。

1.2.3.2 不同料液比对总三萜得率的影响 在乙醇浓度60%、超声温度50℃、超声时间50 min的条件下，料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g/mL)时，以总三萜得率为考核指标，考察料液比对山银花总三萜得率的影响。

1.2.3.3 不同超声温度对总三萜得率的影响 在乙醇浓度60%、料液比1∶25(g/mL)、超声时间50 min的条件下，超声温度分别为30、40、50、60、70℃时，以总三萜得率为考核指标，考察提取温度对山银花总三萜得率的影响。

1.2.3.4 不同超声时间对总三萜得率的影响 在乙醇浓度60%、料液比1∶25(g/mL)、超声温度60℃的条件下，超声时间分别为20、40、60、80、100 min时，以总三萜得率为考核指标，考察超声时间对山银花总三萜得率的影响。

1.2.4 响应面试验 在上述单因素实验的基础上，根据Box－Behnken试验设计原理，采用统计分析软件Design－Expert 8.0.6，以乙醇浓度(A)、料液比(B)、超声温度(C)和超声时间(D)作为因素，以总三萜得率(Y)为考察值，进行4因素3水平的Box－Behnken的中心组合设计，试验因素设计水平见表1。

表1 响应曲面试验因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.5 山银花总三萜含量及得率的测定

1.2.5.1 齐敦果酸标准曲线的制定 本试验采用香草醛－冰醋酸－高氯酸分光光度法测定总三萜含量，具体方法参照参考文献［36］。以齐墩果酸计，在550 nm波长处测定吸光值。绘制齐敦果酸标准溶液吸光度与其质量浓度标准曲线，拟合得线性回归方程为Y=2.8175x－0.0073，R2=0.9992。说明齐墩果酸标准品在0～0.02 mg/mL内线性关系良好。

1.2.5.2 含量及得率测定 精密吸取各设定条件下提取的山银花提取液0.2 mL置于10 mL容量瓶中，按照1.2.3.1中的方法进行测定。根据标准曲线回归方程，由吸光度求出提取液中的总三萜质量浓度，并按照下式计算各处理的总三萜得率:

式中:c为从线性回归方程中求出山银花总三萜的质量浓度，mg/mL;v为提取液体积，mL;n为稀释倍数;m为原料质量，g。

1.2.6 山银花总三萜提取物的抑菌活性测定

1.2.6.1 菌株复苏及菌悬液的制备 用无菌接种环分别刮取少量的活化的菌种于装有100 mL无菌液体培养基中，37℃下恒温摇床培养24 h，用液体培养基稀释制成浓度为106～108CFU/mL的菌悬液，备用。

1.2.6.2 最小抑菌浓度(MIC)的测定 采用倍比稀释法［37］测定山银花总三萜的最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)。将山银花总三萜提取物用5%DMSO(v/v)+1%吐温－80(v/v)溶液配制成初始质量浓度为200 mg/mL的溶液，用0.22μm滤膜过滤，为样品原液，再用液体培养基依次倍比稀释8个浓度，即浓度依次为100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78 mg/mL。将母液及稀释成不同浓度的药液依次加入微量MIC测定板中，每孔0.1 mL;再分别加入已稀释好的各种菌液，每孔0.1 mL。每种分别设置阳性对照(加入0.1 mL菌液和0.1 mL液体培养基)和阴性对照(只加液体培养基)，制备好的微量MIC测定板于37℃恒温箱中培养24 h观察结果，完全没有细菌生长时的最低浓度即为最小抑菌浓度(MIC)。

1.2.6.3 最小杀菌浓度(MBC)的测定 取定量上述无细菌生长的各孔取样分别涂布于相应的无菌琼脂平板上，于37℃条件下培养24 h，观察结果，以平板上无细菌生长的最低药物浓度为MBC。

1.2.7 山银花总三萜提取物的抗氧化活性测定

1.2.7.1 DPPH自由基清除率测定 参照Blois［38］的方法测定，略有变动。取质量浓度分别为3、6、12、24、48、96 mg/mL样品溶液100μL，加入0.2 mmol/L DPPH溶液100μL，充分混匀，避光静置30 min后，以甲醇为空白对照，抗坏血酸(VC)为阳性对照，于517 nm波长处测吸光度。每一样品平行测3次，取平均值。清除率公式表示为:

DPPH清除率(%)=(1－D1/D2)×100

式中:D1为样品或者阳性对照吸光度;D2为空白对照吸光度。

1.2.7.2 ABTS自由基清除率测定 参照Re等［39］的方法测定。在反应体系中，样品溶液质量浓度亦分别为3、6、12、24、48、96 mg/mL，体积100μL，以甲醇为空白对照，抗坏血酸为阳性对照。每一样品平行测3次取平均值，计算公式同1.2.7.1。

1.3 数据处理

单因素实验数据运用Origin 7.5软件绘制趋势曲线图;采用Design－Expert 8.0.6软件进行响应曲面试验设计、数据分析和二次模型的建立，通过对回归方程的解析以及响应曲面的分析获得最佳变量水平，通过F值考察(P＜0.05)模型及因素的显著性。所有试验重复3次，数据结果用均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 不同乙醇浓度对山银花总三萜得率的影响 乙醇浓度对山银花总三萜得率的影响比较大，总三萜得率随乙醇浓度的增大呈先升后降的趋势，乙醇浓度为60%，总三萜得率最高，说明山银花总三萜在60%左右乙醇中溶解度最大，当乙醇浓度在60%以上时，导致某些总三萜物质的溶解度下降，而山银花中一些醇溶性杂质、色素及亲脂性强的成分溶出量增加［40］，从而影响山银花总三萜得率。因此，选择60%乙醇为最佳提取浓度。

图1 乙醇浓度对总三萜得率的影响Fig.1 Effects of ethanol concentrations on total triterpenoids yield

2.1.2 不同料液比对山银花总三萜得率的影响 由图2可知，料液比达到1∶10～1∶25(g/mL)区间时，总三萜得率呈上升趋势，当液料比达到1∶25(g/mL)时，得率达到最高。超过1∶25(g/mL)后，山银花总三萜得率下降较为明显，这可能是由于溶剂用量增大，导致超声波与山银花粗粉作用减弱［41］，总三萜得率降低，因此，料液比以1∶25为宜。

图2 料液比对总三萜得率的影响Fig.2 Effects of ratios of solid to liquid on total triterpenoids yield

2.1.3 不同超声温度对山银花总三萜得率的影响 由图3可知，随着超声温度的升高，总三萜得率不断增大，这可能是因为温度升高导致分子的运动速度和渗透扩散能力加快，加快了三萜类物质的溶出率，60℃时总三萜得率最高，超过此温度后总三萜得率下降，可能是由于温度过高会使山银花中部分三萜类化合物裂解，同时温度的加大也会增加杂质的溶出［42］，影响总三萜测定，所以选超声温度在60℃为宜。

图3 超声温度对总三萜得率的影响Fig.3 Effects of ultrasonication temperatures on total triterpenoids yield

2.1.4 不同超声时间对山银花总三萜得率的影响 从图4可以看出，40 min左右的提取时间可以达到最大的得率，此后逐渐降低。说明在提取40 min左右时，山银花粗粉与提取溶剂充分接触，细胞基本破碎完成，传质达到了饱和，总三萜已充分溶出;继续延长超声时间，可能会影响山银花中部分三萜类化合物的稳定性，同时杂质溶出也会增加，反而降低了提取效果，故选40 min为宜。

2.2 响应曲面法优化山银花总三萜的提取工艺

图4 超声时间对总三萜得率的影响Fig.4 Effects of ultrasonication time on total triterpenoids yield

2.2.1 响应面试验设计与结果 根据Box－Behnken中心组合设计原理，结合单因素实验结果，选取响应面试验因素A(乙醇浓度)、B(料液比)、C(超声温度)和D(超声时间)作为自变量，总三萜得率作为响应值即因变量，采用四因素三水平响应面分析法优化山银花总三萜超声辅助提取工艺参数，响应面试验设计和试验结果见表2。

表2 响应面试验设计方案和试验结果Table 2 Matrix and experiments results of response surface methodology

表3 二次回归模型的方差分析结果Table 3 Analysis of variance for each term of developed quadratic regression model

2.2.2 模型的建立及其显著性检验 采用Design－Expert 8.0.6软件对表2数据进行多元回归拟合、得到山银花总三萜得率(Y)对乙醇浓度(A)、料液比(B)、超声温度(C)和超声时间(D)的二次多项回归模型为:Y=3.3402+0.27583A+0.15692B+0.10133C+0.19058D+0.1465AB+1.25E－003AC+0.08725AD+0.07325BC+0.111BD－0.0575CD－0.53323A2－0.62585B2－0.13047C2－0.0761D2。

对该模型方程方差分析和显著性检验可知(见表3)，该回归模型(P＜0.0001)，说明该模型是极显著的;失拟项P=0.1799＞0.05，表明失拟不显著，即该模型对本试验拟合程度良好;模型的决定系数R2=0.9434，说明总三萜得率的变化有94.34%来自于所选试验因素，因此该回归方程可以很好地描述各试验因素与总三萜得率之间的关系;校正决定系数，说明该模型能解释88.67%响应值的变化。

回归方程各项方差表明，一次项A、B、D极显著(P＜0.01)，C显著(P＜0.05);二次项A2、B2极显著(P＜0.01)，C2、D2不显著(P＞0.05);交互项均不显著，说明不同提取条件与山银花总三萜得率之间不是简单的线性关系。试验因素系数的F值越大则表明该因素对响应值的影响越大，因此影响山银花总三萜得率由大到小的因素为A＞D＞B＞C，即乙醇浓度＞超声时间＞料液比＞超声温度。

2.2.3 响应面交互作用分析 为确定乙醇浓度(A)、料液比(B)、超声温度(C)和超声时间(D)及其交互作用对炒山银花总三萜得率的影响，根据回归方程绘出响应面图，如图5所示。

由图5可知，响应面均为开口向下的凸形曲线，乙醇浓度(A)、料液比(B)、超声温度(C)、超声时间(D)4个实验因子与总三萜得率基本呈抛物线关系，说明在试验范围内响应值存在极高值，即山银花总三萜提取最优条件存在于所设计的因素水平范围之内。

通过Design－Expert 8.0.6软件求解方程，对回归方程进行分析处理，获得超声辅助提取山银花中总三萜化合物的最优提取工艺为:乙醇浓度60.00%、料液比1∶26.75(g/mL)、超声温度62.70℃、超声时间60.00 min，此条件下，山银花总三萜得率的理论预测值为3.36%。为了验证响应面法所得结果的可靠性，考虑到实际操作的可行性，将最佳提取工艺参数修正为:乙醇浓度60%、料液比1∶26(g/mL)、超声温度63℃、超声时间60 min，在优化条件下重复试验3次，实际测得的山银花总三萜平均得率为3.37%±0.02%，与预测值基本吻合，进一步验证了该理论模型的可行性，也说明由该模型优化得出的最佳工艺对于超声辅助提取山银花总三萜化合物的工艺具有实际应用价值。

2.3 抑菌试验结果

采用倍比稀释法研究了山银花总三萜化合物对所选10种常见致病菌的抑制活性，结果见表4。

图5 各两因素交互作用对山银花总三萜得率影响的响应面图Fig.5 Response surface of two factors interaction effects on the extraction of TTL

表4 山银花总三萜对10种常见致病菌MIC/MBC的测定结果(mg/mL)Table 4 MIC/MBC of 10 pathogenic bacteria by TTL(mg/mL)

结果表明，山银花总三萜提取物对试验所选的10种常见致病菌均有较好的抑制作用，尤其是对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、化脓性链球菌和肺炎链球菌抑制作用最强，最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)均在12.5 mg/mL以下。此外，由抑菌活性结果可知，山银花总三萜提取物对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有明显的抑制作用，且对革兰氏阳性菌的抑制能力强于对革兰氏阴性菌的抑制能力。山银花提取物抑菌活性的相关研究也证实［8－9］，山银花具有较强的广谱抗菌作用，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎球菌、铜绿假单胞菌、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、白喉杆菌、绿脓杆菌等大多数细菌均有显著的抑菌和杀菌作用，这与本研究的结果相一致。因此，山银花总三萜具有被研究开发成广谱抗菌剂的潜在应用价值。

2.4 抗氧化试验结果

DPPH和ABTS自由基清除试验结果显示，在浓度为0.5～4 mg/mL范围内，对DPPH和ABTS自由基清除率随山银花总三萜含量增加而增强，呈现出良好的剂量效应关系。山银花总三萜对DPPH和ABTS自由基的清除率高于齐墩果酸，但均低于VC阳性对照。

图6 山银花总三萜DPPH·清除作用Fig.6 The scavenging effects of TTL on DPPH free radical

图7 山银花总三萜ABTS·清除作用Fig.7 The scavenging effects of TTL on ABTSfree radical

3 结论

在单因素实验基础上，采用响应面优化超声波辅助提取山银花总三萜的试验参数并建立其提取工艺二次多项式理论模型，模型拟合度良好。最终确定最佳提取工艺条件为:乙醇浓度60%、料液比1∶26(g/mL)、超声温度63℃、超声时间60 min，在此优化条件下，山银花总三萜平均得率为3.37%±0.02%，与模型预测结果相接近，说明此优化工艺参数可靠。

山银花总三萜提取物具有广谱的抑菌活性，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有较好的抑制作用，尤其是对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、化脓性链球菌和肺炎链球菌抑制作用最强，最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)均在12.5 mg/mL以下。山银花总三萜具有被研究开发成广谱抗菌剂的潜在应用价值。此外，山银花总三萜对DPPH和ABTS自由基均有较好的清除作用，且清除效果与总三萜浓度均呈现一定的正相关关系，但清除率均低于阳性对照VC。

本试验只对山银花总三萜的抑菌抗氧化活性做了一些初步的分析，为山银花资源的开发利用提供了一定的数据支撑。但山银花总三萜成分复杂，其发挥抑菌抗氧化作用的三萜化合物种类及山银花总三萜体内抗菌抗氧化活性评价有待进一步研究。