冠突散囊菌发酵对葛根的活性物质和抗氧化活性的影响

杜 静，王琪琪，王云胜，张传博

(贵州师范大学生命科学学院，贵州贵阳550001)

葛根具有极高药用价值的同时还具有营养保健功效，是一种“药食同源”的植物［1－2］。它含有丰富的活性成分，尤其是研究最为广泛的异黄酮类物质，包括葛根素、芒柄花素、大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素等，具有广泛的抗氧化活性，在治疗心脑血管疾病及改善血脂等方面有着巨大潜力［3－5］。葛根异黄酮的存在形式一般有两种，游离型苷元和结合型糖苷，前者包括大豆苷元等，后者包括葛根素和大豆苷等［6－8］，此外有研究表明，苷元型异黄酮生物活性更强，且异黄酮多以苷元型在体内发挥作用［9－11］。

冠突散囊菌(Eurotium cristatum)作为茯砖茶“发花”工艺中的优势菌，是一种重要的药用真菌，它能分泌多种酶，包括多酚氧化酶、单宁酶、纤维素酶、蛋白酶等，具有降脂、抗氧化等多种医疗保健功能，且对营养环境没有特殊要求，易于生长［12－13］。同时有文献以发酵培养的方式对该菌的次级代谢产物及其生物活性进行研究，表明其代谢产物具有很强的抗氧化作用［14］。

目前已有研究证实可用微生物转化葛根，诸如利用黑曲霉、香菇、红曲霉等转化葛根以生产黄酮等，或研制灵芝发酵颗粒冲剂等，且有研究表明经发酵葛根的抗氧化能力也会得到提高［15－19］。但大部分研究都基于葛根渣或者使用一些常见菌种进行发酵。在前人的研究基础之下，本研究选用茯砖茶中的优势菌冠突散囊菌发酵葛根，探究冠突散囊菌发酵对葛根的影响，对比发酵前后葛根部分活性成分以及抗氧化活性的变化，以期为葛根资源的进一步开发及中药现代化提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冠突散囊菌(Eurotium cristatum) 分离自陕西茯砖茶，为贵州师范大学微生物重点实验室分离保存菌种;鲜葛根 由贵州省隆熙源生态农业有限公司提供，经实验室切片、35℃烘干处理备用;芦丁标准品、葛根素标准品、大豆苷标准品、大豆苷元标准品 HPLC≥98%，上海源叶生物科技有限公司;1，1－二苯基－2－苦基肼(DPPH)、抗坏血酸、色谱级甲醇 天津市恒兴化学试剂制造有限公司;娃哈哈纯净水 杭州娃哈哈集团有限公司;其他试剂 均为分析纯。

RE－2000旋转蒸发器 上海洪旋实验仪器有限公司;FS－600N超声波处理器 上海生析超声仪器有限公司;DH6000II电热恒温培养 天津市泰斯特仪器有限公司;UV759CRT紫外可见分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司;Agilent 1260高效液相色谱仪 安捷伦科技(中国)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 冠突散囊菌孢子悬浮液制备 参照胡谢馨等［20］的方法，略有改动。将冠突散囊菌接种于PDA培养基，28℃恒温培养5 d后刮取冠突散囊菌孢子放入盛有100 mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，120 r/min摇床振荡30 min，最终稀释成浓度4×106个/mL孢子悬浮液待用。

1.2.2 固体发酵 采用胡谢馨等［20］的方法，略有改动。取冠突散囊菌孢子悬浮液，分别接种到葛根固体发酵基质(干葛根片40 g，水40 mL)和大米固体发酵基质(大米40 g，水50 mL)上，接种量为培养基的重量的5%，28℃恒温培养。接种10 d左右，基质已布满冠突散囊菌菌丝，生长达到旺盛，发酵结束。

1.2.3 葛根发酵物的提取制备 参照肖楠等［21］的方法，略有改变，提取制备发酵产物。将发酵产物，即发酵后得到的复合物，于30℃烘干、粉碎，称取10 g粉碎后的产物，采用醇提法进行提取(95%乙醇，料液比1∶10，浸泡过夜后超声提取三次)，抽滤去其残渣，将提取液于40℃旋转蒸发除去乙醇得浸膏，记做FG。以大米培养基发酵的冠突散囊菌和未发酵的葛根作对照，按照同样的方法提取，分别记做DM和WG。

1.2.4 总黄酮含量测定 采用紫外分光光度法测量葛根发酵前后提取物的总黄酮含量［22－23］。以芦丁为标准品(0.2 mg/mL)，并配制成系列浓度，于510 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线。取待测样品于相同条件下测其吸光度，根据标准曲线计算其总黄酮含量。

1.2.5 葛根发酵前后异黄酮含量的HPLC分析

1.2.5.1 色谱条件 参照楚纪明等［24］的方法和药典［25］并进行改变，色谱条件如下:Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm);流动相水(A)－甲醇(B)，梯度洗脱(0～20 min，25%B;20～50 min，25%～55%B;50～80 min，55%～25%B);检测波长250 nm;柱温30℃;流速0.7 mL/min;进样量10μL。

1.2.5.2 溶液制备 各提取物用50%甲醇溶解稀释成所需质量浓度，即为供试样品溶液;精密称取葛根素、大豆苷、大豆苷元标准品各5 mg，置于25 mL棕色容量瓶中，50%甲醇定容，即为混合对照品溶液。

1.2.5.3 方法专属性考察 分别取“1.2.5.2”项下的供试样品溶液和混合标准品溶液，按“1.2.5.1”项下色谱条件进样。

1.2.5.4 线性关系考察 分别取“1.2.5.2”项下的混合对照品溶液1、2、3、4、5 mL，用50%甲醇定容至10 mL，按“1.2.5.1”项下色谱条件进样。

1.2.5.5 方法学考察 参考邵建兵［26］、高晗［27］、姚少姿［28］等的方法，进行方法学考察。精密度试验:取“1.2.5.2”项下的混合对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积，计算各标准品峰面积的RSD;重复性试验:按“1.2.5.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“1.2.5.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，计算RSD;稳定性试验:取供试样品溶液，分别于0、2、4、6、8、10 h进样，记录峰面积，计算各标准品的含量与RSD;加样回收率试验:取已知含量的样品，加入一定量各标准品，照“1.2.3”项条件重新提取，并制备供试样品溶液，按“1.2.5.1”项色谱条件进样，计算加样回收率及RSD。

1.2.6 体外抗氧化能力测定 采用DPPH法［29－32］测定发酵前后葛根的体外抗氧化活性。取2 mL各浓度样品，加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液，振荡摇匀，室温下避光反应30 min，于517 nm处测其吸光值，记做Ai;以等量的甲醇代替DPPH溶液，相同条件下测得吸光值，记做Aj;以等量的50%甲醇代替样品溶液，相同条件下测得吸光值，记做Ac。每个组实验做3个平行，以相同浓度的抗坏血酸溶液做参照，用甲醇溶液调零。DPPH自由基清除率的计算公式如下:

1.3 数据处理

用Excel 2010进行数据统计，GraphPad Prism7.0作图并计算IC50值。

2 结果与分析

2.1 总黄酮含量测定

在葛根基质上冠突散囊菌长势良好，在接种的第2 d就有明显的白色菌丝产生，且较PDA培养基和大米培养基长势更快，说明葛根能为冠突散囊菌提供其所需的各种营养成分。对葛根发酵前后的总黄酮含量测定结果如下:以量取的芦丁标准溶液的体积为横坐标(X)，吸光值为纵坐标(Y)进行回归，得到线性回归方程:Y=0.2856X+0.1533，R2=0.9991，在1.25～10 mL范围内线性关系良好。

发酵前后的样品总黄酮平均含量分别为5.08和5.29 mg/g(n=3)，可知发酵后的总黄酮含量比发酵前有所提高，这一现象说明，冠突散囊菌发酵葛根可以提高其总黄酮的含量。

2.2 葛根发酵前后提取物的HPLC分析

2.2.1 方法专属性考察 供试样品溶液和混合标准品溶液进样测定，得到色谱图如图1所示。由图1可知，特征峰明显，与杂质分离良好，无干扰。且经和对照品比对，确定1、2、3号峰分别为葛根素、大豆苷、大豆苷元。

2.2.2 线性关系考察 以进样浓度(X，mg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，得到葛根素、大豆苷、大豆苷元的回归方程分别是Y=61809.1792X－1.0365(R2=0.99996)，Y=20385.4471X+46.4521(R2=0.99904)，Y=20683.0913X+28.7612(R2=0.99940)。结果表明，三者在0.02～0.1 mg/mL范围内均具有良好的线性关系。

2.2.3 方法学考察 精密度试验:连续进样6次，葛根素、大豆苷、大豆苷元峰面积的RSD值分别为0.19%、1.89%、1.86%(n=6)，表明仪器精密度基本良好。

重复性试验:测得样品中葛根素、大豆苷、大豆苷元含量的RSD值分别为1.80%、1.75%、1.58%(n=6)，表明该方法的重现性良好。

稳定性试验:测定10 h内样品中葛根素、大豆苷、大豆苷元含量的RSD值分别为0.58%、1.95%、1.16%(n=6)，表明在10 h内，样品基本稳定。

加样回收率试验:测得结果见表1，由表1可知葛根素、大豆苷、大豆苷元的平均回收率分别为100.81%、99.40%、95.56%，RSD值 分 别 为0.58%、0.61%、0.52%(n=6)。

图1 供试品(A)和对照品(B)的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of substances(B)and sample(A)of Pueraria lobata

2.2.4 样品含量测定 样品中葛根素、大豆苷、大豆苷元含量测定结果见表2。结果表明，阴性对照组DM，即用大米培养基培养的冠突散囊菌样品，未检测到三者相应的吸收峰;而发酵前后三者含量变化显著，发酵产物中葛根素和大豆苷元的含量分别是未发酵葛根的1.6倍和4.9倍，而大豆苷的含量则降低了，相比未发酵葛根其含量少了近1/2。

2.2.5 色谱比对分析 在1.2.5.1色谱条件下，对发酵前后以及阴性对照组DM的图谱进行叠加比对分析，图谱见图2。由图2可知，阴性对照组DM的图谱中基本没有检测到相应的峰;而发酵组FG与未发酵组WG则检测出较多的峰。根据图谱差异性分析可知，在相同的进样浓度下，经冠突散囊菌发酵，葛根中的化学成分发生显著变化，其中1～5号以及8号吸收峰经过发酵以后强度变弱，而9号、10号和11号吸收峰经发酵则得到更强的吸收峰，其中10号吸收峰为WG组所没有的。可以推测，葛根经过冠突散囊菌的发酵后，通过两者相互之间的转化作用使得葛根或者真菌本身的代谢产物发生了改变，从而导致了物质成分的变化。

2.3 体外抗氧化能力测定

由图3可知DPPH自由基的清除率随各样品浓度的增加而增加，尤以阳性对照组VC的清除能力最强，但当样品浓度达到4 mg/mL时，四者对DPPH自由基的清除率能力基本持平。而当样品浓度小于0.5 mg/mL时，发酵后的葛根FG对DPPH自由基的清除率明显高于阴性对照组DM和未发酵葛根WG，当样品浓度大于0.5 mg/mL时，则DM的抗氧化性略高于发酵后的葛根FG。但无论是发酵后的葛根(FG)还是阴性对照组(DM)在各个浓度下对DPPH自由基的清除率都比未发酵葛根(WG)高。四者的IC50(mg/mL)值见表3，由表3可知，四者的抗氧化活性由强到弱依次为:VC＞FG＞DM＞WG。

表1 加样回收试验结果(n=6)Table 1 Results of sample recovery test(n=6)

表2 葛根样品中各物质含量测定结果(x±s，n=3)Table 2 Results of various substancesin P.lobata samples(x±s，n=3)

图2 发酵组FG、未发酵组WG和阴性对照组DM的HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of fermentation group FG and unfermented group WG and negative controlled substance DM

3 讨论与结论

本研究基于冠突散囊菌与葛根的双向固态发酵体系，经HPLC指纹图谱比对分析，发现发酵前后葛根成分变化显著，对其中三种异黄酮成分的含量进行测定，结果葛根素和大豆苷元含量显著增加，而大豆苷的含量减少。此结果与施英英［33］研究结果不同，其研究结果为大豆苷元减少，而葛根素和大豆苷均增加，推测造成该现象的原因如下，首先使用的菌种不同，其所具有的酶系和代谢产物有很大差别;其次，其固态发酵培养基中除了葛根渣外还含有30%的麸皮，而麸皮中也含有一些类黄酮物质。

图3 各样品浓度与DPPH自由基清除率的关系Fig.3 The relationship between the concentration of each sample and the scavenging rate of DPPH radical

表3 葛根发酵前后抗氧化IC50值(n=3)Table 3 IC50 value before and after P.lobata fermentation(n=3)

通过测定发酵前后总黄酮的含量，结果显示发酵后总黄酮含量仅略微提高;同时HPLC色谱比对发现DM组的发酵产物中不含此3种异黄酮;此外，资料表明葛根中的异黄酮类物质结构相似，只在取代基或酚羟基位置有所差别［34］;由此推测导致异黄酮含量发生变化的原因很可能是葛根中异黄酮结构类似物之间利用冠突散囊菌在代谢过程中产生的一系列酶发生相互转化［35－36］，而其具体的转化途径还需要进一步研究。

对发酵前后葛根的抗氧化活性进行DPPH法评价分析，结果表明发酵后产物对DPPH自由基有一定的清除作用，具有一定的抗氧化活性，且其抗氧化活性远远大于未经处理的葛根，也比单纯的菌种的抗氧化活性强。但是，由于在DM的色谱图中并未检测到葛根主要异黄酮成分相应的吸收峰，而其抗氧化活性却远高于未发酵的葛根，甚至接近于发酵葛根，故推测冠突散囊菌本身的代谢产物对抗氧化活性的改变发挥着重要作用，其作用甚至远大于葛根异黄酮含量的提高。李莹［37］从冠突散囊菌的大米发酵产物中分离鉴定了11个化合物，其中化合物6(Variecolorin O)和化合物7(Neoechinulin A)表现出较强的抗氧化活性;李玉婷等［38］研究表明冠突散囊菌中的黄色素具有优于VE的抗氧化活性;彭晓赟等［14］从冠突散囊菌的发酵产物中分离鉴定了9个化合物，其中4种苯甲醛类化合物具有很好的抗氧化作用等，这些研究结果均进一步印证了上述推测。同时，由于只采用了一种体外抗氧化活性评价方法，故不能对葛根发酵前后的抗氧化活性进行总体评价，因此论据略有不足，还需要多采用几种评价方法，进一步验证其体外抗氧化活性。

综上所述，利用冠突散囊菌发酵葛根，可以提高葛根中的部分活性成分的含量，且发酵后产物具有一定的抗氧化活性。而目前对于冠突散囊菌的研究多集中在分离鉴定、命名及其化学成分的研究上，亦或是探究其对茯砖茶口感品质的作用，而很少研究冠突散囊菌在其他方面的应用。本研究利用冠突散囊菌对中药材葛根进行固体发酵，大大提高该菌研究潜力和价值的同时，也为葛根资源的进一步开发，甚至是中药炮制提供一个研究思路和方向，推动中药的现代化进程。