镉胁迫对不同品种辣椒种子萌发及苗期抗性生理的影响

龙春丽, 宋拉拉, 胡明文, 夏忠敏, 秦利军

(1.贵州大学生命科学学院， 贵阳 550025； 2.贵州省农业科学院辣椒研究所， 贵阳 550006；3.山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室， 贵阳 550025；4.贵州大学农业生物工程研究院， 贵阳 550025；5.贵州省土壤肥料工作总站， 贵阳 550005)

辣椒(CapsicumannuumL.)属茄科(Solanaceae)一年生或多年生植物，是重要的茄果类蔬菜，营养价值较高，在世界各地被大范围种植和食用[1]。我国辣椒种植面积已超过130万hm2，总产量约2 800万t，每年总产值约为700亿元[2]。其中，贵州是辣椒的主产区之一，仅2018年种植面积就高达35万hm2，占全国辣椒种植总面积的16.6%，是贵州省规模化和集中度最高的蔬菜单品[3]。近年来，化学农药及肥料的不合理施用，导致农业生态环境不断恶化[4]。镉是农耕地中常见的重金属污染物，作物通过根系吸收的镉超过阈值时，往往会抑制其生长[5]。研究表明，镉胁迫会引起植株表型异常，如叶、茎黄化，株高降低，叶宽变窄，茎围缩小等[6-8]。另外，廖芳芳等[9]研究发现，镉对不同品种辣椒种子萌发的影响不同，抗性品种的种子萌发指标显著高于不抗品种；时小东等[10]研究镉对米荞1号种子萌发影响发现，低浓度的镉能促进种子萌发，提高种子萌发率、萌发势、萌发指数和活力指数等指标，而高浓度镉则会抑制种子萌发。贵州辣椒资源丰富，如牛角椒、线椒、簇生朝天椒和小山椒等[11]，因此筛选和培育耐镉的地方辣椒品种对促进贵州辣椒产业的发展具有十分重要的意义。本试验以贵州15个地方辣椒品种中筛选出的两个耐镉辣椒品种LCL 4和LCL 6为材料，研究CdCl2胁迫对其种子萌发特征指标(发芽率和发芽势)及抗性生理指标(MDA含量和AOEs酶活)的影响，分析这些指标在两个品种中的变化差异，以期为筛选培育耐镉地方辣椒品种、实现耐镉辣椒品种规模化种植提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料试剂：辣椒品种LCL 4和LCL 6，种子由贵州省农科院辣椒研究所提供。CdCl2、CuSO4和冰醋酸(分析纯，≥99.5%)购于天津科密欧化学试剂有限公司；丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量测定试剂盒以及超氧化歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(peroxidase，POD)和过氧化氢酶(catalase，CAT)酶活性测定试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

主要仪器：台式离心机(BECKMAN COULTER Microfuge 20 R Centrifuge)、分析天平(DENVER INSTRUMENT Max 210 g，d=0.1 mg)、水浴锅(Thermo SCIENTIFIC HAAKE SC 100)、涡旋振荡器(Thermo SCIENTIFIC M 37610-33 CN)、精密pH计(METTLER TOLEDO FiveEasy FE 20)、可见光分光光度计(Thermo SCIENTIFIC Varioskan Flash 3001)。

1.2 方 法

1.2.1镉胁迫下种子萌发指标测定

分别配制200 mg·L-1的CdCl2溶液和0.01 g·mL-1的CuSO4溶液各500 mL备用。挑选籽粒饱满、大小一致的辣椒种子若干浸泡于0.01 g·mL-1的CuSO4溶液中消毒60 min，之后用无菌蒸馏水反复冲洗5～6次，晾干备用。种子晾干后撒播于垫有两层无菌滤纸的玻璃培养皿(直径为9 mm)中(每皿50粒)，用移液枪吸取6 mL 200 g·mL-1的CdCl2溶液完全浸润滤纸，加上盖后以Parafilm封口膜(PM-996)进行密封以防止水分蒸发，对照组以清水替代CdCl2溶液，每个处理设3个重复。观察并记录种子萌发情况。以胚根突破种皮露白作为种子萌发的标志，实验过程中及时补充CdCl2溶液或蒸馏水以保证滤纸湿润。辣椒种子萌发后第7天计算发芽势，第14天时计算发芽率。分别按下列公式计算发芽率和发芽势。

发芽率(%)=(14 d内供试种子发芽数/供试种子总数)×100%；

发芽势(%)=(7 d内供试种子发芽数/供试种子总数)×100%。

1.2.2辣椒苗培养及镉胁迫处理

分别将两品种种子撒播于育苗盘中，在16 h光照(28 ℃)/8 h黑暗(23 ℃)条件下自然萌发，待辣椒苗长至6 cm时，挑选长势一致的幼苗移栽至花盆(盆高18 cm，直径15 cm，每盆装培养基质5 kg)后，置于温度为(25±2)℃，湿度为80%，光照为1 800 lx的玻璃温室中培养。每个品种种植15株，对辣椒幼苗进行常规管护。待辣椒幼苗长至4片真叶时，用配制的150 mg·L-1的CdCl2溶液进行灌根处理，CdCl2溶液施用量以花盆底部开始流出液体为宜。分别于第0天(处理前)、第1、3、5天剪取相同叶位的叶片0.2 g，液氮速冻后，保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2.3镉胁迫下辣椒苗MDA含量测定

取不同时期的冻存辣椒叶片各0.1 g，分别加入900 μL生理盐水进行研磨制备成10%组织匀浆液体，于4 000 r·min-1条件下离心10 min，取上清液为待测样品。按照MDA测定试剂盒使用说明操作，测定待测样品在532 nm波长下的吸光值，每组设3个重复。

1.2.4镉胁迫下辣椒苗AOEs活性测定

待测样按照1.2.3步骤进行制备，SOD、POD和CAT酶活性测定参照试剂盒说明书进行。 测定待测样品在550、420 nm和405 nm波长下的吸光值，分别计算SOD、POD和CAT酶活性，每组设3个重复。

1.2.5数据处理

利用SPSS 17.0软件对测定数据进行统计分析，采用Excel 2010软件制图。

2 结果与分析

2.1 镉对不同品种辣椒种子萌发的影响

由表1可知，200 mg·L-1的CdCl2溶液处理下LCL 6种子发芽率为96.26%，而LCL 4种子发芽率为96.67%，后者在胁迫条件下发芽率略高于前者，说明200 mg·L-1的CdCl2溶液对两个品种的辣椒种子萌发存在一定的抑制作用，且对LCL 6种子的抑制较强。LCL 4种子发芽势对照组为100%，处理组为96.67%，而LCL 6发芽势对照组为96%，处理组为93.3%，表明LCL 4种子在200 mg·L-1的CdCl2胁迫条件下具有较好的萌发特性，且发芽的整齐度较好。

表1 200 mg·L-1 CdCl2溶液对两品种辣椒种子萌发的影响

2.2 镉胁迫对叶片MDA含量的影响

MDA含量可反映植物受伤害的程度，故MDA含量可以用作评价生物的抗逆性和受伤害程度的指标[12]。150 mg·L-1CdCl2处理辣椒幼苗后，LCL 4和LCL 6辣椒叶片表现为随着时间的推移MDA含量逐渐下降的变化特征。LCL 4品种在处理第3天时，MDA含量与第1天相比有一定程度的增加，而仅为处理前(第0天)的56.25%。在处理第5天时两个品种MDA含量都显著降低，且LCL 6中MDA含量略低于LCL 4，两者差异不显著。

2.3 镉胁迫对叶片SOD活性的影响

CdCl2溶液处理后，2个辣椒品种叶片中SOD活性均有一定增加，之后表现为随胁迫时间推移SOD活性出现先增后降的变化趋势。在CdCl2胁迫第3天时，LCL 4品种和LCL 6品种中SOD酶活均达到最大值，分别为913.73 U·(g·min)-1和756.25 U·(g·min)-1。在第5天时，两个品种SOD酶活性开始下降，LCL 4降至762.2 U·(g·min)-1，而LCL 6降至524.53 U·(g·min)-1。这种先升后降的趋势符合一般抗性植物响应逆境胁迫的规律。总体而言，LCL 4品种中SOD活性比LCL 6活性高，说明前者在应答CdCl2胁迫时抗性更强。

2.4 镉胁迫对叶片CAT活性的影响

CdCl2胁迫后CAT活性测定表明，随着镉处理时间的延长，CAT与SOD变化趋势类似，即先增加后下降。在处理第5天时，两个品种CAT含量均开始下降，LCL 4品种中CAT活性为125.34 U·(g·min)-1，为胁迫处理前(第0天时)的 61.6%，而LCL 6品种中CAT活性为116.40 U·(g·min)-1，为胁迫处理前(第0天时)的72.8%。整体上，这两个品种CAT变化趋势一致，但LCL 4品种相比较LCL 6品种活性强，说明前者对H2O2有较强的清除能力。

2.5 镉胁迫对叶片POD活性的影响

POD是植物体内重要的抗氧化酶，可以清除植物细胞中的H2O2，进而减少活性氧对植物的伤害。POD活性测定表明，随着胁迫时间延长POD活性也表现为先增加后减少的变化趋势。CdCl2胁迫第3天时，POD活性均达到最大值，LCL 4为1116.05 U·(g·min)-1，LCL 6为981.32 U·(g·min)-1。第5天时降至最低值，分别为处理前的70.8%和78.2%。

3 讨 论

土壤中重金属污染严重制约了农业的可持续发展[11]。据调查，贵州土壤中重金属镉含量的平均值为0.659 mg·kg-1，显著高于无公害蔬菜及水果的产地环境中的镉含量(0.3～0.6 mg·kg-1)[13]。彭思云等[14]研究表明，贵州省土壤中镉和汞是主要的重金属污染物，其中镉的单因子污染指数高达4.05，说明全省境内镉污染较为严重。农作物中镉元素过量积累不仅会导致植物生长发育受阻，还会通过食物链进入动物和人体内，进而引发多种疾病[15-16]。因此，筛选耐镉抗镉作物品种，对于农业经济的可持续发展及降低镉素的毒害作用具有十分重要的意义。本研究以前期筛选的2个耐镉地方辣椒品种LCL 4和LCL 6为材料，分析镉胁迫对其种子萌发及对幼苗抗性生理变化等的影响，以期为培育耐镉辣椒新品种提供理论依据。

本研究表明，LCL 6和LCL 4种子的发芽率分别为96.26%和96.67%，与对照组相(99%和100%)比较均有一定程度下降，说明200 mg·L-1CdCl2溶液在一定程度上抑制了种子的萌发，这与廖芳芳等[9]、孙亚莉[17]、宋拉拉等[18]研究结果一致，但两者萌发率降幅均无显著差异，说明此浓度CdCl2胁迫对LCL 6和LCL 4种子萌发率无显著抑制作用。但发芽势指标测定表明，CdCl2胁迫后LCL 4发芽势为96.67%，低于对照组的100%，而LCL 6发芽势为93.33%，低于对照组的96%。结合发芽率和发芽势结果分析，两个耐镉品种中，以LCL 4品种种子受镉胁迫的影响较小。另外，以150 mg·L-1CdCl2溶液对辣椒幼苗进行胁迫时发现，LCL 4和LCL 6叶片中MDA含量随着时间的推移逐渐下降。在LCL 4品种中，胁迫处理第3天时，MDA含量与第1天相比有小幅增加，但仅为处理前的56.25%。说明镉胁迫导致辣椒幼苗细胞质膜发生氧化损伤，但两个品种能较快调节自身保卫机制降低质膜氧化产物MDA的积累，从而保护细胞。

植物在应答逆境胁迫时可通过调动自身保护酶活性，增强其对不良环境的抵抗能力[19-20]。研究表明，当植物体内O2-·含量异常时往往会引起CAT、SOD[21]、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)、POD[22]、谷光甘肽还原酶(glutathione reductase，GR)等保护酶活性的高表达以消除O2-·或H2O2的过量积累。CdCl2胁迫后AOEs酶活测定表明，CdCl2胁迫3 d时，LCL 4品种和LCL 6品种中SOD酶活均达到极大值，分别为913.73 U·(g·min)-1和756.25 U·(g·min)-1，而在胁迫5 d时，两个品种SOD酶活性开始下降，LCL 4降至762.2 U·(g·min)-1，而LCL 6降至524.53 U·(g·min)-1；在胁迫处理第5天时，LCL 4品种中CAT活性为125.34 U·(g·min)-1，为胁迫处理前(第0天时)的 61.6%，而LCL 6品种中CAT活性为116.40 U·(g·min)-1，为胁迫处理前(第0天时)的72.8%。LCL 4品种CAT活性较LCL 6强，说明对H2O2有较强的清除能力。另外，随着胁迫时间延长POD活性也表现为先增加后减少的变化趋势。CdCl2胁迫第3天时，POD活性均达到最大值，LCL 4为1 116.05 U·(g·min)-1，LCL 6为981.32 U·(g·min)-1。以上研究为进一步培育地方耐镉辣椒品种、促进农业经济的可持续发展及探讨耐镉的调控机制提供理论依据。