幽门螺杆菌鞭毛蛋白A单克隆抗体的制备与鉴定

邱 席，刘 伟，庄睿娟，陈亚琼，邓晨希，王团老*

(1.厦门大学药学院，福建 厦门 361102；2.厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，福建 厦门 361102)

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)在人类胃中定植，与胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡以及胃癌密切相关[1-2].1994年，国际癌症研究机构已将其列为第一类致癌因子[3].然而，目前临床上对于幽门螺杆菌的诊断方法并不理想，本研究旨在探索更好的诊断方法.

幽门螺杆菌的鞭毛伸出菌体外约2.5 μm，鞭毛自细胞膜长出后，游离于细胞膜外；伸出菌体外的鞭毛主要为鞭毛鞘包裹的鞭毛丝，由鞭毛蛋白A(FlaA)和FlaB二聚体组成，其中FlaA是主要的鞭毛蛋白[4].FlaA核苷酸序列高度保守，不同幽门螺杆菌的FlaA核苷酸序列同源性可达90%以上[5],且具有良好的免疫原性和反应原性.综上特点，本研究选择幽门螺杆菌的FlaA为抗原，通过传统的杂交瘤技术制备其单克隆抗体(mAb)，并对其特性进行鉴定，以期为建立新的幽门螺杆菌检测技术提供实验参考.

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

限制性内切酶SacⅠ、XholⅠ和T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司；质粒小量提取试剂盒和PCR产物胶回收试剂盒均购自上海生工生物工程股份有限公司；大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21菌株、骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14和载体PET-28a为本实验室保存；6～8周龄雌性BALB/c小鼠(SPF级)由厦门大学实验动物中心提供；弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、次黄嘌呤、胸腺嘧啶、氨基蝶呤和聚乙二醇(PEG1500)购自Sigma公司；胎牛血清和小牛血清购自Hyclone公司；RPMI-1640和DMEM培养基购自Invitrogen公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和卡那霉素购自Biosharp公司，考马斯亮蓝购自麦克林公司，尿素购自西陇化工公司.

1.2 实验方法

1.2.1 抗原的制备

1) 重组质粒的构建：根据在NCBI数据库(http:∥ncbi.nlm.nih.gov)中查到的HpFlaA基因序列，设计引物并委托上海生工生物工程股份有限公司进行合成.按照KOD(TOYOBO公司)高保真PCR体系50 μL，引物10 mmol,幽门螺杆菌基因组DNA(ATCC)模板200 ng.PCR程序：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s,68 ℃ 45 s,72 ℃ 10 min,35个循环4 ℃ 10 min.通过SacⅠ与XholⅠ双位点酶切，并通过T4连接酶将目的片段与载体PET-28a重组.将连接产物转化至BL21感受态细胞，挑取单菌落并扩大培养，用质粒小量提取试剂盒提取质粒；并用SacⅠ与XholⅠ限制性内切酶，37 ℃ 酶切1 h,经琼脂糖凝胶电泳检验.

2) 蛋白的表达、纯化与复性：将连接产物转化的大肠杆菌涂布于卡那霉素抗性的LB平板，37 ℃培养箱中过夜，挑取单菌落置于5 mL卡那霉素抗性培养基中，IPTG诱导后离心收菌；十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后考马斯亮蓝染色，脱色.挑阳性菌落，扩增至2瓶800 mL卡那霉素抗性的LB培养基中，IPTG诱导后8 000 r/min、4 ℃离心10 min收菌并超声破碎(功率200 W，工作3 s，间歇6 s，共10 min)；取上清和少许沉淀经SDS-PAGE验证蛋白表达位置.用2 mol/L尿素洗涤沉淀2次，然后用8 mol/L 尿素溶解，4 ℃梯度透析复性.

1.2.2 mAb的制备

1) 小鼠的免疫：将纯化的HpFlaA融合蛋白与等体积的FCA充分乳化，BALB/c小鼠四肢及背部皮下多点注射融合蛋白50 μg/只.2周后进行第2次免疫，将纯化的HpFlaA融合蛋白与等体积的FIA充分混合，四肢及背部皮下多点注射加强免疫，2周后第3次免疫，同第2次.第3次免疫后7～10 d,眼球取血,通过间接酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清抗体效价.于融合前3 d选择抗体滴度最高的1只小鼠脾脏加强免疫100 μg.

2) 细胞融合：在融合之前准备饲养层细胞，取1只13 d左右小鼠的胸腺和1只8周小鼠的腹腔巨噬细胞作为饲养细胞.脾脏免疫3 d后，无菌取脾脏制成单细胞悬液，与生长状态良好的SP2/0-Ag14细胞融合，采用常规PEG促融合方法，融合后的细胞接种于96孔板，置于37 ℃、5%(体积分数)CO2培养箱中培养.

3) ELISA和杂交瘤细胞的筛选：将0.5 μg/mL的抗原包被96孔酶标板，以融合10 d后杂交瘤细胞的上清为一抗，以SP2/0-Ag14细胞上清为阴性对照，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG为二抗.测定杂交瘤细胞上清的450 nm吸光度(A450)值(P)和SP2/0-Ag14细胞上清的A450值(N)，P/N≥2.1为阳性.将阳性孔中细胞进行有限稀释克隆化，直至出现阳性单克隆，扩大培养并及时冻存.

4) 腹水的制备和抗体的纯化：BALB/c小鼠腹腔注射500 μL无菌液体石蜡，10 d后，接种杂交瘤细胞1×106～2×106个/只，待小鼠腹部明显膨胀，抽取腹水，12 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清.0.45 μm滤器(Millipore公司)过滤，将过滤后的腹水用Protein G进行纯化，纯化后经磷酸盐缓冲液(PBS)4 ℃ 透析后进行SDS-PAGE鉴定.

1.2.3 mAb的特性鉴定

1) 亚型的鉴定：根据mAb亚型检测试剂盒(Thermo Scientific 公司)说明书对抗体进行分型.

2) 用间接ELISA方法计算亲和常数.以0.5(Ag)和1.0(Ag′) μg/mL的抗原质量浓度包被酶标板，将抗体倍比稀释，以抗体浓度为横坐标，A450值为纵坐标作图，曲线出现平台期时表示抗原被全部结合，以此时的A450值为100%，找出50%对应的A450值，代入公式，即可得亲和常数[6]:

式中c(Ag)和c(Ag′)为不同的包被抗原浓度，c(Ab)和c(Ab′)为对应的mAb浓度.

3) 效价检测：对纯化后的抗体用间接ELISA方法检测效价，设置阴性对照，P/N≥2.1的最高抗体稀释倍数即为抗体效价.

4) 蛋白免疫印记(Western blot)鉴定mAb特异性：将实验室自制的His标签蛋白和HpFlaA蛋白在95 ℃变性5 min后进行常规SDS-PAGE检测.220 mA恒流，55 min转移到硝酸纤维素膜上，5%(质量分数)的牛奶(PBS+0.1%(体积分数)Tween-20，即PBST配制)封闭1 h；用5%(质量分数)的BSA稀释mAb和His标签抗体，室温孵育1 h，PBST洗3次，每次7 min；HRP标记的羊抗鼠二抗用PBST按1∶5 000 稀释，室温孵育1 h，PBST洗3次，每次7 min，使用化学发光液显色.

5) 样本的来源和处理：临床样本为患者的粪便，由北京新兴四寰生物技术有限公司筛选提供.其中5份阳性样本(3份弱阳性“+”、1份较强阳性“++”、1份强阳性“+++”和3份阴性“—”样本).用天平称取相同量样本，用PBS溶解，作为抗原.

2 结果与分析

2.1 抗原的制备

2.1.1 重组质粒的构建

根据目的片段的基因序列设计引物，通过PCR扩增得到1 300 bp左右的基因片段(图1(a))，与预期相符.将重组质粒PET-28a-HpflaA经SacⅠ和XholⅠ限制性内切酶双酶切后(图1(b))得到1 300 bp左右的片段，与PCR结果相符，为目的基因片段，且测序结果正确，证明重组质粒构建成功.

图1 重组质粒PET-28a-HpflaA的构建Fig.1 Construction of recombinant plasmid PET-28a-HpflaA

2.1.2 重组蛋白的表达纯化

将质粒转化至BL21感受态，涂板，挑取单菌落进行IPTG小量诱导，经SDS-PAGE并进行考马斯亮蓝染色，结果显示在约54 ku处有一条清晰条带(未诱导则无此条带).随后将阳性菌落大量扩增，经超声破碎、离心获得裂解液、上清和沉淀，并进行SDS-PAGE鉴定(图2(a))，结果显示蛋白在沉淀中大量表达.从包涵体中对HpFlaA进行纯化，以1 μg/μL BSA为对照，纯化的HpFlaA抗原质量浓度达到3 μg/μL(图2(b))，且纯化后杂蛋白减少，纯度较高，可用于免疫小鼠.

(a)重组蛋白可溶性鉴定，M.蛋白分子质量标准(下同)，1.上清,2.沉淀,3.全菌体；(b)纯化后重组蛋白的浓度测定.图2 重组蛋白的表达与鉴定Fig.2 Expression and identification of recombinant protein

2.2 mAb的制备和鉴定

2.2.1 单克隆杂交瘤细胞株的构建与筛选

小鼠免疫3次后，眼眦取血，以未免疫小鼠的血清为阴性对照，间接ELISA法测定小鼠血清效价.选用效价最高的小鼠进行脾脏加强免疫，并进行细胞融合.细胞融合后10 d左右，取细胞上清，通过间接ELISA法进行融合检测,共得到196个阳性孔.由于此时所得阳性孔中的细胞并不是由同一杂交瘤细胞增殖而来，所以为了得到单克隆细胞需要对阳性孔进行有限稀释克隆化，共6轮，得到5株单克隆杂交瘤细胞(2G2、2G10、3E2、3E4和4H3).取这5株杂交瘤细胞的上清进行ELISA验证，以SP2/0-Ag14细胞上清为阴性对照(NC).图3表明这5株杂交瘤细胞都能稳定分泌HpFlaA抗体.

图3 间接ELISA筛选杂交瘤细胞株Fig.3 Screening of hybridoma cell lines by indirect ELISA

2.2.2 抗体的分型

抗体的分型结果决定单抗后续的纯化和应用方法.收集杂交瘤细胞上清，根据mAb亚型ELISA检测试剂盒说明书，对抗体进行分型；并以HRP标记的鼠抗(GAM-HRP)为阳性对照，在酶标仪上测定各孔的A450值，结果如表1所示，可见5株杂交瘤细胞的mAb均为IgG1型.

表1 mAb的亚型鉴定Tab.1 Subtype identification of mAb

2.2.3 腹水的制备与纯化

采用小鼠体内诱生腹水的方法大量制备抗体，并用Protein G层析介质进行纯化.纯化后的抗体经SDS-PAGE后用考马斯亮蓝染色、脱色，结果显示获得5株高纯度的mAb(图4).纯化后抗体的质量浓度测定结果如下：2G2为4.9 mg/mL，2G10为5.1 mg/mL，3E2为0.95 mg/mL，3E4为5.1 mg/mL，4H3为3.5 mg/mL.从SDS-PAGE结果(图4)可以看出mAb的重链约为54 ku，轻链约为26 ku.每个抗体有两条重链和两条轻链，因此mAb的分子质量约为160 ku.

图4 SDS-PAGE检测纯化后mAb的纯度Fig.4 The purity of purified mAb identified by SDS-PAGE

2.2.4 抗体的亲和常数测定

通过间接ELISA法得到mAb的亲和曲线(以2G2为例，如图5所示)，在曲线上找出50%的A450值，代入公式得到2G2、2G10、3E2、3E4和4H3的亲和常数Ka分别为2.7×107，1.7×108，8.0×107，1.1×108和1.1×108L/mol.5株杂交瘤细胞的mAb的亲和常数均大于107，表明上述mAb的亲和力较高.

图5 间接ELISA测定2G2 mAb的亲和曲线Fig.5 Affinity curves of the 2G2 mAb detected by indirect ELISA

2.2.5 抗体的效价检测

对纯化后的抗体用间接ELISA方法检测效价，设置阴性对照(NC)，结果如图6所示:2G2、2G10、3E2、3E4和4H3的效价分别为1∶128 000，1∶1 024 000，1∶512 000，1∶512 000和1∶1 024 000，其中2G10和4H3的效价最高.

图6 纯化后mAb的效价Fig.6 Titers of purified mAb

2.2.6 抗体的特异性检测

采用间接ELISA和Western blot同时验证抗体的特异性.将实验室自制的His标签蛋白(His-protein，作为对照)和HpFlaA同时包被酶标板(0.5 μg/mL)，以5株杂交瘤细胞的mAb为一抗，结果如图7(a)所示，mAb只能和HpFlaA反应.同时以His标签抗体和5株杂交瘤细胞的mAb为一抗，进行Western blot验证，如图7(b)所示,5株杂交瘤细胞的mAb均不与自制的His标签蛋白反应，仅特异性地识别目标蛋白，与间接ELISA结果相同.

图7 mAb的特异性检测Fig.7 Specificity detection of mAb

2.2.7 双抗夹心ELISA的初步建立

采用棋盘法将5株mAb分别作为包被抗体，其对应的标记生物素(Bio-)的抗体作为检测抗体，进行配对筛选.结果如表2所示，可知2G2-2G10、2G2-3E4、2G2-4H3、2G10-2G10、3E4-3E4和3E4-4H3为阳性配对.其中2G2-3E4的反应值稍高于其他配对，但仍不理想，因此后续需要对此体系进行优化，以达到较好的准确度和灵敏度.

表2 双抗体夹心ELISA配对筛选Tab.2 Pairwise screening bydouble antibody sandwich ELISA

2.2.8 双抗体夹心ELISA检测临床样本

采用上述双抗体夹心ELISA法中配对效果最好的一组2G2-3E4(以2G2为包被抗体，以3E4为检测抗体)检测临床样本，结果如表3所示.虽然3份弱阳性样本中出现了一份漏检，但是3份阴性样本(6～8)的检测结果均正确，未出现假阳性；较强和强阳性样本的检测结果均正确.由此初步断定所建立的双抗体夹心ELISA体系可以用于检测临床样本.

表3 双抗体夹心ELISA检测临床样本Tab.3 Clinical sample detection bydouble antibody sandwich ELISA

3 讨 论

目前，对于幽门螺杆菌感染的诊断方法依据是否依赖胃镜检查分为两类：一类是依赖于胃镜活检的侵袭性检查法，包括快速尿素酶实验、胃黏膜直接涂片染色镜检、基因检测方法等，缺点是胃镜检查操作繁琐，对患者造成疼痛，不适合儿童和妊娠期妇女；另一类是不依赖于胃镜活检的非侵袭性检查法，包括13/14C呼气试验，15N-氮排除实验，免疫学血清抗体测定等，13/14C呼气试验在临床上应用普遍，优点是准确率较高，但缺点是价格昂贵或伴有放射性污染.免疫学血清抗体测定检测特异性较高，但患者并不是在感染幽门螺杆菌后体内立刻出现特异性抗体，而且在幽门螺杆菌根除后抗体仍然可以存在几个月甚至一年，还存在交叉反应性抗体[7-8].侵袭性和非侵袭性检查法对于感染幽门螺杆菌的诊断都不让人十分满意，而近年来发现检测粪抗原技术是一种价格低廉、安全、准确、患者依从性好的诊断方法[8].幽门螺杆菌定植在人胃黏膜上皮细胞，上皮细胞脱落时会携带含幽门螺杆菌抗原的幽门螺杆菌代谢产物，与死亡菌体一起通过粪便排出体外[9]，因此可通过检测粪幽门螺杆菌抗原推断患者是否感染幽门螺杆菌.幽门螺杆菌的毒力因子主要有尿素酶、鞭毛、黏附素、热休克蛋白、细胞毒素相关蛋白 A 和空泡毒素等[10-11].目前已有研究成功制备出幽门螺杆菌全菌体、UreB、HpaA和空泡毒素等重要毒力因子的mAb，而本研究成功制备出FlaA的mAb，因此可以通过将幽门螺杆菌不同毒力因子的mAb以及全菌蛋白的mAb同时检测临床粪便样本，进而比较出检测效果、准确度、灵敏度俱佳的mAb，以建立更准确、迅速、灵敏的粪抗原检测方法.然而由于粪便成分比较复杂[12-13]，且不同患者粪便中幽门螺杆菌抗原成分的量也有差异，而幽门螺杆菌的不同抗原成分的mAb在检测时可以互为补充，以最大限度地降低临床上对幽门螺杆菌感染者的漏检率，大大提高诊断幽门螺杆菌感染的准确率，预防由于幽门螺杆菌感染所诱发的疾病,有较好的应用前景.

本研究成功构建了PET-28a-HpflaA重组表达质粒，通过原核表达系统成功表达出HpFlaA融合蛋白.以纯化的融合蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，通过传统的杂交瘤技术成功制备出5株能稳定分泌抗HpFlaA的mAb的杂交瘤细胞株.对纯化后的mAb进行性质鉴定，结果表明抗体具有纯度好、亲和力高、特异性好、效价高的特点.本研究还将5株mAb通过棋盘法进行配对，以建立较好的双抗夹心ELISA检测体系，结果表明以2G2为包被抗体，以3E4为检测抗体的检测体系反应值较高，并用此体系检测8份临床样本发现阴性、较强阳性和强阳性样本的检测结果均正确，但3份弱阳性样本中却出现了一份漏检和一份不确定结果，推测可能是因为所建立的双抗夹心检测方法准确度较好，但灵敏度还存在缺陷，在检测弱阳性样本时由于其中所含HpFlaA抗原较少，未达到检测体系的检测下限，所以出现漏检.

后续需要进一步优化2G2-3E4双抗夹心ELISA体系，以达到更高的灵敏度，降低检测下限，从而降低漏检率，再用优化后的体系检测大量的临床样本，进一步验证其准确性和灵敏度,为HpFlaA检测试剂盒的制备奠定实验基础.

致谢：感谢北京新兴四寰生物技术有限公司在临床样本检测过程中提供的帮助.