基于还原态DES荧光特性测定槐米中槲皮素含量*

李祥昀，侯梦园，李培培，刘艳菊

1.河南中医药大学第三附属医院，河南 郑州450008；2.河南中医药大学，河南 郑州450046

槐米又名白槐、槐花，是豆科植物槐的干燥花蕾。《神农本草经》将其列为上品，其药性苦，微寒，归肝、大肠经，具有凉血止血、清肝泻火等功效。槐米中主要活性成分为黄酮类物质，如芦丁、槲皮素等。槲皮素作为黄酮醇类代表性化合物，具有很高的药用价值，能够抗癌［1－3］、抗炎［4－5］、抗病毒［6］、保护心脑血管［7］、抗氧化［8］和抑制黑色素生成［9］。因此，快速、准确测定槐米中槲皮素的含量具有重要意义。文献报道槲皮素含量测定的方法主要有高效液相色谱法［10－13］、化学修饰电极法［14］、薄层扫描色谱法［15］、高效毛细管电泳法［16］等。荧光分光光度法因具有简便、快速、专属性好等特点得到了众多学者的关注。目前，基于还原态DES（4，4′－二叠氮二苯乙烯－2，2′－二磺酸二钠四水合物）的荧光特性，利用荧光分光光度法测定槐米中槲皮素含量的研究未见报道。

前期研究发现DES自身没有荧光，但其还原产物具有较强的荧光发射。槐米中的活性成分槲皮素具有较强的抗氧化能力，可以还原DES，生成还原态DES，发出较强的荧光。本研究通过改变溶液的pH值、槲皮素浓度及槲皮素与DES反应的时间等条件，对该方法的检测性能进行分析，建立一种简单、准确、快速定量检测槲皮素的荧光分光光度法，可用于槐米中槲皮素含量的检测，为槐米的综合开发及临床安全用药提供实验依据。

1 仪器与试药

FLS 1000荧光分光光度计（Edinburgh公司，英国），超纯水仪（默克化工技术有限公司，上海）。

槐米购自河南中医药大学第三附属医院药房（产地：安徽亳州，批号：190601），经河南中医药大学药学院谢小龙博士鉴定为豆科植物槐的干燥花蕾。槲皮素对照品（批号：150803），购自上海融禾医药科技有限公司。DES（4，4′－二叠氮二苯乙烯－2，2′－二磺酸二钠四水合物），购自阿拉丁试剂有限公司。三（羟甲基）氨基甲烷（Tris），购自北京索莱宝科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备精密称取槲皮素对照品适量，用体积分数70%乙醇溶液溶解，得到4 mmol·L－1的槲皮素对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备取槐米粉末4 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加入体积分数80%乙醇100 mL。水浴加热至87℃，保持微沸回流120 min后趁热过滤，然后用体积分数80%乙醇定容至100 mL，即得［17－19］。

2.3 检测方法取4 mmol·L－1槲皮素对照品溶液20μL和DES（15 mmol·L－1）溶液50μL，室温反应5 min后，加入530μL Tris－HCl（0.1 mol·L－1，pH＝6）缓冲溶液，在激发波长（Ex）为383 nm，狭缝宽度2 nm的条件下，测试溶液的荧光发射光谱。

2.4 可行性分析以Tris－HCl（0.1 mol·L－1，pH＝6）溶液为参比溶液，试验组溶液为：①槲皮素（20μL，1 mmol·L－1）＋DES（50μL，15 mmol·L－1）＋Tris－HCl（530μL，0.1 mol·L－1，pH＝6）；②槲皮素（20μL，1 mmol·L－1）＋Tris－HCl（580μL，0.1 mol·L－1，pH＝6）；③DES（50μL，15 mmol·L－1）＋Tris－HCl（550μL，0.1 mol·L－1，pH＝6）。使用2.3项下的方法，测试上述3种混合溶液的荧光发射光谱。实验结果如图1所示，槲皮素、DES溶液均未有明显的荧光发射，而槲皮素和DES的混合溶液具有较强的荧光信号，产生这种现象的原因可能是DES的共轭结构两端吸电子性的叠氮基被还原为给电子性的氨基，氨基的给电子能力提高了分子的最高占有轨道能级，能级间隙减小，使得溶液在紫外光照射下发出强烈的荧光［20］。因此基于槲皮素的抗氧化性与DES还原产物的荧光特性所建立的槲皮素含量测定方法是可行的。

图1 可行性实验的荧光光谱图

2.5 条件优化

2.5.1 pH值优化槲皮素结构受pH值影响较大，在强酸强碱条件下其结构会发生改变［21］。在pH为4、5、6、7、8、9的条件下，分别测定反应体系的荧光强度。如图2－A所示，pH值从4至6时溶液荧光强度逐渐增大，在pH＝6时溶液的荧光发射强度达到最大，当pH值超过6时荧光强度逐渐减弱。因此选择pH＝6的缓冲溶液进行荧光测定。

2.5.2 时间优化测试槲皮素和DES在反应时间为5 min，10 min，15 min，20 min，25 min，30 min时溶液的荧光强度。如图2－B所示，实验结果表明混合溶液荧光强度在5～30 min内几乎不随反应时间而变化。选择槲皮素与DES反应5 min后测试溶液的荧光光谱。

3 槐米中槲皮素的含量测定

3.1 线性关系考察精密称取槲皮素对照品适量，用体积分数70%乙醇溶解，配制0.25 mmol·L－1、0.5 mmol·L－1、0.75 mmol·L－1、1.00 mmol·L－1、2.00 mmol·L－1、4.00 mmol·L－1的槲皮素对照品溶液。根据2.3项下方法测试荧光光谱。实验结果表明，槲皮素浓度为0.25～4.00 mmol·L－1的范围内，溶液的荧光发射强度与槲皮素浓度的对数之间存在良好的线性关系，线性方程为Y＝104 119.79 X＋84 927.823（X代表槲皮素浓度的对数值，Y代表DES还原产物的荧光强度），R2＝0.999 6。见图3。

图2 槲皮素测试条件优化的荧光光谱图

图3 不同槲皮素溶液浓度对应的荧光强度

3.2 共存物质的影响常见的金属阳离子、铵根离子以及Glc（葡萄糖）可能会影响槲皮素检测的准确性［22］。实验结果表明在槲皮素浓度为1.00 mmol·L－1条件下，50倍浓度的K＋、Ca＋、Zn2＋、Mg2＋、NH4＋以及Glc对反应体系的荧光强度没有明显影响，表明该方法的选择性良好。见图4。

3.3 重复性实验取5份槐米样品，根据2.2项下的方法制备供试品溶液，按照2.3项下的方法进行荧光检测。根据对照品线性回归方程，得到样品中槲皮素含量的平均值为0.1325 mg·g－1，RSD为2.2%，表明测定方法的重复性较好。

3.4 加样回收率实验取9份已知含量（槲皮素0.132 5 mg·g－1）的槐米粗粉，3份一组，分别按照0.8倍、1.0倍、1.2倍加样量加入槲皮素对照品，按照2.2项下的方法制备待测样品溶液。按照2.3项下的方法测定溶液的荧光强度，并根据线性方程计算出槲皮素含量的理论值，结果列于表1。根据实验数据得到槲皮素的平均回收率为98.47%，相对标准偏差（RSD）为5.51%（n＝9）。实验结果表明，该方法符合定量分析的要求。

图4 共存物质对检测结果影响的荧光光谱图

表1 加样回收率实验测试结果

4 结论

基于槲皮素的强抗氧化性与DES还原产物的荧光特性，对槐米中槲皮素含量进行测定。结果表明，体系的最佳pH值为6，在5～30 min内槲皮素与DES混合溶液的荧光强度无明显变化。在最佳条件下，槲皮素浓度为0.25～4.00 mmol·L－1时，槲皮素的浓度与还原态DES的荧光强度之间呈现良好线性关系，检测限为5.45×10－3mmol·L－1，R2＝0.999 6。常 见金属离子（K＋、Ca＋、Zn2＋、Mg2＋），NH4＋和Glc对测定结果无明显干扰。该方法操作简便，具有良好的抗干扰性、重现性，可为槐米药材质量评价提供参考。