丹酚酸A调控C3aR的表达治疗缺血性疾病作用机制研究*

马璐璐，陈璐，张璐莎，方乐玉，李春晓，张丽媛，杨文杰，王倩怡，王虹

天津中医药大学，天津301617

丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，为活血化瘀要药［1－4］。丹酚酸A（salvianolic acid A，SAA）是丹参中一种主要的水溶性酚酸类化合物，其在心、脑血管病的治疗方面具有重要的研究价值［5－8］。研究表明，SAA可以通过抑制血小板活化达到抗凝血的效果［9］，血小板表面过敏毒素C3a受体（anaphylatoxin C3a receptor，C3aR）属于固有免疫系统中的补体成分，过敏毒素C3a与其关联的G蛋白偶联受体C3aR结合后，促进内皮通透性，募集和激活中性粒细胞，触发炎症反应和血栓形成［10－11］。SAA可以治疗临床缺血性疾病，且可能参与过敏毒素受体C3aR的表达，因此本研究构建体外血小板和中性粒细胞活化模型，通过比浊法、流式细胞术、免疫荧光技术、酶联免疫吸附测定法等检测相关基因和蛋白的表达，探讨SAA是否通过调控C3aR的表达抑制血小板活化、聚集、黏附及中性粒细胞脱颗粒治疗临床缺血性疾病，以期为临床上治疗缺血性疾病机制研究提供思路。

1 材料

1.1 动物SD大鼠，SPF级，雄性，40只，体质量200～220 g；C57BL／6小鼠，SPF级，雄性，6～8周，40只；以上动物购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2016－0002，饲养于温度19～25℃，相对湿度40%～60%的环境下。

1.2 药物及试剂丹酚酸A（纯度＞99%，成都德思特生物技术有限公司，批号：DST180201－008）；阿司匹林肠溶片（Asprin，每片0.1 g，拜耳医药保健有限公司，批号：BJ27810）；二磷酸腺苷二钠盐（adenosine diphosphate，ADP，美国Sigma－Aldrich公司，批号：SLBN0134V）；罗丹明标记的鬼笔环肽（美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：R415）；APC anti－mouse／rat CD62p antibody（美国Biolegend公司，批号：148304）；水合氯醛（成都市科龙化工试剂厂，批号：P1110）；小鼠中性粒细胞提取试剂盒（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，批号：LZS1091）；髓过氧化物酶（myloperoxidase，MPO）试剂盒、弹性蛋白酶（elastase，NE）试剂盒、乳铁蛋白（lactoferrin，LF）试剂盒、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号分别为：E－BC－K074－S、E－EL－M0444c、E－EL－M0746c、E－EL－M2732c）。

1.3 仪器Flex Station®3酶标仪（美国Molecular Device公司）；倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；多功能酶标仪（美国BioTek公司）；64R型低温高速离心机（美国Beckman公司）。

2 方法

2.1 血小板悬液的制备采用5%水合氯醛麻醉SD大鼠，腹主动脉取血10 mL，放入盛有ACD（柠檬酸38 mmol·L－1、柠 檬 酸 钠75 mmol·L－1、葡 萄 糖124 mmol·L－1）的15 mL离心管中摇匀，1 200 r·min－1离心10 min，取上清液，即为富含血小板的血浆（platelet rich plasma，PRP）。PRP在3 000 r·min－1下离心10 min，沉淀部分即为血小板，在血小板改良台式液（无钙）中洗两次，用改良台式液稀释成适当浓度，使其吸光度值在1左右，备用。

2.2 中性粒细胞的提取及缺氧模型的制备根据小鼠中性粒细胞提取试剂盒说明书对小鼠外周血中中性粒细胞进行提取。取上述制备好的中性粒细胞，分别与生理盐水、100μmol·L－1的丹酚酸A及10μmol·L－1的C3aR抑制剂于37℃孵育20 min后，置于缺氧小室中，通入混合气（1%O2、5%CO2、94%N2），于37℃恒温培养箱中缺氧处理4 h。在1 000 g下离心20 min，取上清液，即为缺氧诱导的中性粒细胞活化模型，其中常氧组为空白对照组。

2.3 比浊法检测血小板聚集率取上述制备好的血小板，检测20μmol·L－1ADP诱导的血小板聚集率以及加入1μmol·L－1、10μmol·L－1、100μmol·L－1SAA后的聚集率；检测200 nmol·L－1过敏毒素C3a诱导的血小板聚集率以及加入SAA后的聚集率。用微孔法测血小板聚集率，使用酶标仪检测405 nm波长处样品的OD值。

血小板聚集率＝（ODt＝0－ODt＝30）／ODt＝0×100%（30 min内OD值的变化）。

2.4 免疫荧光技术检测血小板在纤维蛋白原上的黏附准备载玻片，包被50 mg·L－1纤维蛋白原溶液150μL，4℃孵育过夜，PBS洗涤。血小板与生理盐水、不同浓度的SAA（1μmol·L－1、10μmol·L－1、100μmol·L－1）及10μmol·L－1C3aR抑制剂于37℃孵育20 min，ADP诱导10 min，取血小板悬液150μL加到包被有纤维蛋白原的载玻片上，37℃孵育20 min，4%多聚甲醛溶液固定20 min，PBS洗3次，除去多余的多聚甲醛，采用鬼笔环肽对血小板避光标记20 min，荧光显微镜下观察并随机选取三个视野拍照，Image J软件测量血小板面积。

2.5 流式细胞仪检测血小板膜蛋白CD62p和C3aR的表达取上述制备好的血小板，分别与生理盐水、不同浓度的SAA（1μmol·L－1、10μmol·L－1、100μmol·L－1）及10μmol·L－1C3aR抑制剂于37℃孵育20 min，加20μmol·L－1ADP于37℃孵育10 min，分别加入CD62p－APC和C3aR－FITC抗体，室温避光孵育30 min，加入500μL 1%多聚甲醛，充分混匀，用流式细胞仪检测血小板CD62p和C3aR的荧光强度。

2.6 酶联免疫吸附测定法检测MPO、NE、LF及MMP9的水平严格按照酶联免疫吸附测定试剂盒说明书操作检测MPO、NE、LF及MMP9的水平。

2.7 统计学处理采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料进行正态性检验，正态分布资料用均数±标准差（±s）表示。两组间均数的比较采用t检验，多组间均数的比较采用单因素方差分析，方差齐组间两两比较采用LSD－t检验；方差不齐组间两两比较采用Dunnett－T3检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 不同浓度的丹酚酸A抑制ADP诱导的血小板聚集、黏附和释放利用ADP处理血小板构建体外血小板活化模型，与生理盐水组比较，经ADP处理后血小板的聚集、与纤维蛋白原的黏附及CD62p表达显著增高（P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05）；与ADP诱导组相比，不同浓度SAA处理组和阿司匹林阳性对照组血小板的聚集、与纤维蛋白原的黏附及CD62p表达显著降低（P＜0.05）。提示不同浓度的SAA可抑制ADP诱导的血小板聚集、黏附和释放。见图1。

图1 不同浓度SAA对ADP诱导的大鼠血小板聚集、黏附和释放的影响

3.2 C3aR介导参与血小板聚集、黏附和释放利用ADP处理血小板构建体外血小板活化模型，与生理盐水组比较，经ADP处理后血小板的聚集、与纤维蛋白原的黏附和CD62p表达显著增高（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001）；与ADP诱导组比较，C3aR抑制剂处理组血小板的聚集、与纤维蛋白原的黏附及CD62p表达显著降低（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.05）。提示C3aR参与机体血小板的活化过程。见图2。

3.3 SAA抑制C3aR表达发挥抗血小板作用利用ADP处理血小板构建体外血小板活化模型，与生理盐水组比较，经ADP处理后的血小板C3aR表达水平显著增高（P＜0.05）；与ADP诱导组比较，不同浓度的SAA处理组血小板的C3aR表达水平显著降低（P＜0.05）。利用C3a处理血小板构建体外血小板活化模型，与未处理组比较，经C3a处理后的血小板聚集水平显著增高（P＜0.05）；与C3a诱导组比较，不同浓度的SAA处理组血小板的聚集水平显著降低（P＜0.05）。提示不同浓度的SAA抑制C3aR的表达发挥抗血小板作用。见图3。

图2 C3aR对ADP诱导大鼠血小板活化、聚集和黏附的影响

图3 SAA抑制C3aR表达发挥抗血小板作用

3.4 SAA对缺氧诱导的中性粒细胞脱颗粒的抑制作用利用1%O2处理中性粒细胞构建体外中性粒细胞活化模型，与常氧组比较，经1%O2处理后中性粒细胞的MPO、NE、MMP9、LF水平显著增高（P＜0.05）；与缺氧诱导组比较，SAA处理组中性粒细胞的MPO、NE、MMP9、LF水平显著降低（P＜0.05）。见图4。

3.5 C3aR介导参与中性粒细胞脱颗粒利用1%O2处理中性粒细胞构建体外中性粒细胞活化模型，与常氧组比较，经1%O2处理后中性粒细胞的MPO、NE、MMP9、LF水平显著增高（P＜0.05）；与缺氧诱导组比较，C3aR抑制剂处理组中性粒细胞的MPO、NE、MMP9、LF水平显著降低（P＜0.05）。提示中性粒细胞活化可能与过敏毒素受体C3aR有关。见图5。

图4 SAA对缺氧诱导小鼠中性粒细胞脱颗粒的影响

图5 C3aR对缺氧诱导小鼠中性粒细胞脱颗粒的影响

4 讨论

血小板和中性粒细胞在维持血管和组织完整性方面起着至关重要的作用。血小板和巨核细胞通过胞外介质和微粒与中性粒细胞相互作用，增强中性粒细胞的激活作用［12－17］。激活的中性粒细胞表达组织因子，与血小板相互作用时促进免疫血栓形成［18－19］。血小板－中性粒细胞的相互作用对心血管系统和免疫系统的稳定有显著影响，被认为是治疗心血管疾病的方向［20－21］。补体作为免疫系统的重要组成部分，激活后会放大和促进中性粒细胞和血小板的激活［22］。本研究分别针对血小板激活和中性粒细胞脱颗粒对丹酚酸A的免疫调节进行评价。ADP是体外导致血小板活化的常见诱因，缺氧诱导的中性粒细胞脱颗粒反应是中性粒细胞发挥免疫效应的主要原因。本研究发现，ADP导致血小板活化，并引起固有免疫反应，缺氧导致中性粒细胞活化，发生脱颗粒反应；而丹酚酸A预孵育可以抑制补体成分过敏毒素受体C3aR表达，从而抑制血小板活化和中性粒细胞脱颗粒，发挥免疫学效应。

血小板是巨核细胞释放的无核细胞碎片，经过一个多阶段的细胞质分裂过程，在数天内将生物活性化合物浓缩成颗粒，以细长的前体形式释放，这些前体经历多次反复裂变达到最终大小［23］。血小板内含有多种颗粒成分，在发挥止血功能时可以释放生物活性介质［24］，且在机体防御入侵病原体方面发挥重要作用。血小板在血管损伤时通过其表面免疫受体的表达和分泌炎症调节因子、免疫调节因子，识别并控制侵入的病原体，释放刺激物促进组织修复，发挥免疫效应［25－26］。血小板表面免疫受体C3aR属于固有免疫系统中的补体系统，在感染或组织应激时补体激活，产生一组具有不同生物学功能的效应分子［27－28］，小片段C3a通过与其特定受体C3aR相互作用介导炎症。虽然过敏性毒素受体C3aR通常与炎症细胞相关，但体外研究表明它们也在血小板上表达［29］。血小板是具有高度免疫活性的细胞，通过补体系统的激活，可以在血管炎症过程中协调动脉粥样硬化形成中的初始信号事件［30］。本研究发现，C3aR抑制剂可以显著抑制ADP诱导的血小板活化；丹酚酸A不仅可显著抑制ADP诱导的血小板活化，还能下调C3aR的表达。推测丹酚酸A可通过调节C3aR的表达抑制血小板的活化，C3aR是调节血小板活化途径的重要蛋白。

中性粒细胞构成血液中最丰富的白细胞群体，对有害刺激的病原体进行早期先天免疫反应［31］。中性粒细胞表达大量的氧化酶和蛋白水解酶，这些酶预先形成并储存在颗粒中。中性粒细胞损伤周围组织的倾向与其激活状态密切相关，增强脱颗粒和呼吸爆发活动的启动是造成重大损害的先决条件。缺氧显著上调了中性粒细胞主要颗粒的释放，在一定程度上促进了内皮细胞损伤［32］。中性粒细胞在刺激后更容易受到C3a／C3aR的激活，发生脱颗粒反应［33］。本研究发现，缺氧可引起中性粒细胞脱颗粒，增加NE、MPO、MMP9、LF的释放；丹酚酸A可以显著抑制中性粒细胞中NE、MPO、MMP9、LF的水平；而C3aR抑制剂可以显著抑制缺氧诱导的中性粒细胞脱颗粒。推测丹酚酸A可通过调节C3aR的表达抑制中性粒细胞的活化。

综上所述，丹酚酸A可能通过调控C3aR的表达抑制血小板聚集、黏附和释放，防止中性粒细胞脱颗粒，从而预防和治疗临床缺血性疾病。