基于细胞自噬蛋白LC3、p62研究不同微粒的复方蜥蜴散对大鼠溃疡性结肠炎的作用*

王艺臻，王佳林，朱西杰

1.宁夏医科大学，宁夏 银川750004；2.宁夏医科大学附属回医中医院，宁夏 银川750004

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种结直肠的慢性炎症性疾病，主要表现为腹痛、腹泻、便血等，病程迁延难愈，被世界卫生组织列为疑难疾病［1－2］。细胞自噬具有防止病理产物积聚，处理细胞内损伤蛋白、衰老细胞器的功能，而LC3、p62为细胞自噬的主要蛋白标志物。本研究将基于自噬蛋白LC3、p62研究不同微粒的复方蜥蜴散对2，4，6－三硝基苯磺酸（2，4，6－trinitro－benzenesulfonic acid，TNBS）诱导UC模型大鼠的影响，为复方蜥蜴散寻找可能相关的细胞自噬靶点，为中医药治疗UC提供新思路。

1 材料

1.1 动物SPF级健康雄性SD大鼠42只，6～8周龄，体质量180～220 g，由宁夏医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（宁）2015－0001，饲养于宁夏医科大学动物房，12 h／12 h的光照／黑夜循环，温度（22±2）℃，湿度45%～50%，自由饮食饮水。

1.2 药物与试剂复方蜥蜴散（蜥蜴15 g，黄芪30 g，党参15 g，山药15 g，白术15 g，延胡索10 g，枳壳15 g，砂仁10 g，旋覆花10 g，佛手10 g，白芍15 g，乌梅10 g，半夏10 g）（宁夏医科大学附属回医中医院，批号：20180632）；柳氮磺吡啶（美国Sigma公司，货号：901553－1G）。LC3、p62、β－actin、山羊抗兔二抗抗体［柏奥易杰（北京）科技有限公司，批号分别为：bs－8878R、bs－2951R、BE0021、BE0101］；ECL发光液（南京凯基生物科技发展有限公司，货号：KGP1127）；蛋白marker（美国Thermo公司，货号：26616）；Tris、PBS磷酸盐缓冲液［范德（北京）生物科技有限责任公司，货号分别为：SS1426、IH0132］；TNBS（美 国Sigma公 司，货 号：IPVH00010）；PVDF膜（Millipore公 司，货 号：IPVH00010）；TBST、BCA蛋白定量试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，货号分别为：p25133、KGPBCA）；脱脂奶粉（美国BD公司，批号：0252038）；甘氨酸［范德（北京）生物科技有限责任公司，批号：20180306］；SDS－PAGE蛋白上样缓冲液（凯基生物科技发展有限公司，货号：KGP101X）；甲醇（天津市永大化学试剂有限公司，批号：20200903）；SDS（日本Wako公司，货号：CAH4859）；水合氯醛（天津大茂公司，批号：20201007）。

1.3 仪器BP310P型称量天平（Sartorius公司）；centrifuge5417R型低温高速离心机（Eppendorf公司）；MDF－U72V型超低温冰箱（SANYO公司）；电泳仪（美国Bio－Rad公司）；RM2016型切片机（德国莱卡LEICA公司）；SI－0246型旋涡混合器（美国SI公司）；CKX41型光学显微镜（日本奥林巴斯公司）；XR型凝胶成像分析系统（美国Bio－Rad公司）。

2 方法

2.1 药物制备不同微粒的复方蜥蜴散：复方中药经过粉碎、高温灭菌后，蒸2.5 h，晾晒1周干燥后，分别过80目筛（复方蜥蜴散80目）和过100目筛（复方蜥蜴散100目），将80目筛和100目筛的不同微粒按照1∶1等量混合（复方蜥蜴散100＋80目），用双蒸水煎煮浓缩后制成每毫升含0.15 g生药的糊剂混悬液，经高温灭菌后，4℃备用。

2.2 动物分组、造模及给药将36只SD雄性大鼠，随机分为6组，即空白组、模型组、柳氮磺吡啶（0.3 g·kg－1）组、复方蜥蜴散80目（1.5 g·kg－1）组、复方蜥蜴散100目（1.5 g·kg－1）组、复方蜥蜴散100＋80目（1.5 g·kg－1）组，每组7只。用石蜡油润滑的聚丙烯管（外径2 mm）缓慢插入大鼠肛门上段8 cm结肠内缓慢注入5%TNBS（0.1 g·kg－1）与50%乙醇的混合液0.25 mL灌肠复制UC模型，空白组用0.25 mL生理盐水灌肠。造模结束后，除空白组外，各组随机抽取1只大鼠，取结肠，进行HE染色。若杀检大鼠出现结肠炎性细胞浸润、充血水肿及溃疡等病理变化，及大鼠出现大便次数增多、粪质稀薄、黏液脓血便、食量减少、毛发晦暗无泽、消瘦拱背等则为大鼠UC模型复制成功。

造模成功后，各组灌服相应的药物，空白组和模型组给予等体积的生理盐水，连续给药14 d，观察大鼠的表观指标。

2.3 HE染色观察大鼠结肠组织病理变化末次给药后，大鼠禁食24 h，用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉。每组随机选3只大鼠剖腹，取结肠，用40 ng·L－1甲醛固定。

脱蜡：用二甲苯Ⅰ和Ⅱ脱蜡各10 min；入水：100%乙醇Ⅰ和Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各5 min→自来水冲洗5 min→苏木素染色10 min→自来水冲洗30 min→盐酸乙醇分化15 s→自来水冲洗30 min→伊红染色5～8 min→过水；脱水：70%乙醇1 min→80%乙醇1 min→90%乙醇5 min→95%乙醇5 min→100%乙醇Ⅰ和Ⅱ各5 min；透化：二甲苯Ⅰ和Ⅱ各10 min；中性树脂封片；显微镜下进行观察。

2.4 Western Blot法检测大鼠结肠组织自噬相关蛋白的表达末次给药后每组随机选3只大鼠，取结肠。提取结肠组织蛋白并测定其浓度后将样品进行变性，－80℃下分装保存。

配制浓缩胶和分离胶后进行电泳，电泳前进行检漏，加所需蛋白样品并在最左侧加入5μL的Maker，在200 V电压下电泳30 min；将PVDF膜于甲醇中激活10 s，激活后的PVDF膜置于转膜液中保存，切胶并放入转膜液中，30 mA转膜50 min；转膜结束后，将PVDF膜置于双层塑料膜间，并滴加1 mL转膜液，裁剪所需要的蛋白条带，PBST浸洗3次，每次15 min，封闭1 h；然后滴加200μL一抗，4℃过夜，次日将条带置于PBST中，冲洗3次，每次10 min，滴加500μL二抗，室温孵育1 h后，将条带置于PBST中，浸洗3次，每次10 min，进行曝光，每个条带滴加200μL的ECL发光液，暗室内曝光、显影保存图像。用Image J软件对蛋白条带图进行分析。

2.5 统计学方法采用SPSS 21.0软件进行处理，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析。假设检验采用双侧检验，取α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠的表观指标模型组大鼠出现黏液脓血便、精神状态萎靡、扎堆少动、毛色晦暗；复方蜥蜴散80目组、复方蜥蜴散100＋80目组、复方蜥蜴散100目组、柳氮磺吡啶片组黏液脓血便逐渐消失、精神状态佳、活跃、毛色光洁，以复方蜥蜴散100＋80目组为优。

3.2 观察结肠组织病理学空白组大鼠结肠黏膜表面光滑平整，大肠腺结构完整清晰可见，细胞形态正常，无炎性细胞浸润；模型组结肠黏膜表面大面积破损凸凹不平，有脓肿及溃疡面形成，腺体萎缩，细胞形态改变，大量炎性细胞浸润，排列紊乱不规则；复方蜥蜴散100＋80目组和柳氮磺吡啶组结肠黏膜组织可见到炎性细胞浸润，但明显少于模型组；复方蜥蜴散80目组仍可见到浸润大量炎性细胞，甚至达到黏膜下层，腺体结构不完整；复方蜥蜴散100目组无明显变化。见图1。

图1 大鼠肠黏膜病理学改变（HE，×200）

3.3 Western Blot法检测大鼠结肠组织p62、LC3蛋白表达与空白组比较，模型组大鼠结肠组织p62蛋白表达明显下调，LC3 II／LC3 I水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，复方蜥蜴散100＋80目、复方蜥蜴散100目、复方蜥蜴散80目及柳氮磺吡啶组均可明显上调p62蛋白表达，降低LC3 II／LC3 I水平（P＜0.05），以复方蜥蜴散100＋80目组为优。见图2。

图2 Western Blot法检测大鼠结肠组织p62、LC3蛋白表达

4 讨论

UC属于中医学“肠癖”“下利”“腹痛”等范畴，因饮食和情志内伤，复感外邪导致脾胃升清降浊功能失常，气机斡旋失司，浊毒积滞于肠道，肠络损伤，黏膜在缺血缺氧状态下自噬激活，失于传化糟粕和津液，肠黏膜血败肉腐，化脓成痈，内成溃疡而致本病发生［3－6］。正如《圣济总录·脓血痢》所言：“积热蕴结，血化为脓，脓血相杂，故成脓血痢”。朱西杰教授采用复方蜥蜴散治疗UC，通降浊毒、化瘀解毒、促黏膜血行、扶正以修复创面［7－8］。

方中选用中药如补中益气的黄芪、山药，可扶助正气，黄芪和山药中的主要活性物质黄芪多糖和山药多糖具有抗炎、调节自噬、改善氧化应激、提高机体免疫力的作用［9－10］。“去邪”是祛除“毒”“瘀”等邪气，早在《黄帝内经》有云：“坚者削之……结者散之，留者攻之”，为治疗癌瘤的基本原则。故采用解毒散结的蜥蜴为君，并以软坚散结的生牡蛎，二者合用增强解毒散结之功；臣以半枝莲、三七活血止痛，增强祛瘀生新之功效；酸收固涩的延胡索、海螵蛸合涩肠止泻的乌梅与温补的鹿角霜合用，共同发挥促进肠道蠕动的作用。药理研究发现，宁夏密点蜥蜴及牡蛎酶解产物可降低体内炎症因子水平，调节机体免疫活性；延胡索、海螵蛸、鹿角霜可抗血小板聚集、抑制白细胞减少、促进红细胞生长及血管生成，具有加速溃口愈合的功效，三药合用共同修复损伤的黏膜组织［11－12］。有研究显示，乌梅提取物通过降低NF－κB p65蛋白表达和抑制脂质过氧化反应，从而减轻肠炎大鼠结肠黏膜组织中肠道水肿程度，以发挥预防溃疡和减少赘生物形成的作用［13－20］。综上，诸药合用共奏扶正补气血、解毒化瘀之功。叶天士在《临证指南医案》有云：“汤者荡也，去大病用之；散者散也，去急病用之；丸者缓也，舒缓而治之也”。本复方在修复肠黏膜损伤中的给药形式采用散剂以获得较好疗效，而散剂治疗中颗粒的大小又是临床疗效的决定因素，故本研究选择不同微粒的复方晰蜴散。

研究表明，LC3参与自噬形成到成熟的全部过程，当自噬发生时，LC3 I被活化，结合磷脂酰乙醇胺转变为LC3 II，通常以LC3Ⅱ／LC3Ⅰ的比值判断自噬水平的高低［21］。p62作为调控蛋白和泛素蛋白的聚集物作用中心，参与调控蛋白代谢及传导多个信号通路，是隔离有害蛋白的泛素结合保护器［22－25］。已有研究显示，p62与自噬标志物蛋白LC3共定位可防止有害蛋白在体内存积，二者免疫共沉淀参与细胞自噬的修饰与延伸，在自噬研究中起到积极作用［26－29］。本实验结果显示，复方蜥蜴散100＋80目组为优，能明显降低大鼠结肠黏膜上皮细胞中LC3 II／LC3 I水平，上调p62表达，其表达趋势与复方蜥蜴散可解毒化瘀，促进肠黏膜血液循环，修复受损肠黏膜，促进肠道有害物质向营养及能量转化，使溃疡创面得以愈合相一致［30］。通过维持正常细胞自噬的作用，清除细胞内受损的细胞器、蛋白质，起到隔离有害蛋白，促进黏膜修复，降低结肠炎症反应，缓解肠道平滑肌兴奋痉挛的作用，为促进结肠功能的恢复提供有利的环境。