祛风宣肺汤治疗冷刺激联合屋尘螨诱导哮喘小鼠的作用机制*

林利，郭婕，朱佳

1.南京中医药大学附属医院，江苏 南京210000；2.南京医科大学附属逸夫医院，江苏 南京210000

支气管哮喘是常见的慢性呼吸道疾病，临床上以可逆性气流受限和气道高反应性为主要表现。全球范围内哮喘患者总数超过3亿［1］。近年来，哮喘患病率显著上升［2］。临床观察发现，气温降低是诱发哮喘发作的常见环境因素［3］。哮喘患者的门诊就诊人数及住院率的增长常伴随着冷风过境、气温骤降等气候变化［4－5］。目前，哮喘的临床治疗主要以糖皮质激素和β受体激动剂等为主，可有效改善哮喘患者的临床症状，提高患者的生活质量，但仍存在部分患者药物不耐受、药物不敏感、停药后易复发、药物不良反应大、患者依从性差等问题［6］，哮喘控制的现状不尽如人意。

中医学认为，风寒之邪引动伏痰而发哮喘属于“冷哮证”的范畴，拟以祛风化痰、扶正温阳论治。研究表明，中西医结合疗法治疗哮喘，在稳定病情、减少发作次数、减轻药物不良反应等方面具有优势［7－8］。祛风宣肺汤是由江苏省名中医朱佳教授根据多年临床经验，结合中医药治疗哮喘的深刻认识总结的而成，治疗咳嗽变异性哮喘、变应性咳嗽方面颇有疗效。实验证实，祛风宣肺汤具有降低气道高反应性，减轻肺部炎性细胞浸润，抑制肺组织神经源性炎症的作用［9－11］。本研究主要考察了祛风宣肺汤对冷刺激联合屋尘螨（house dust mite，HDM）诱导过敏性哮喘小鼠的干预机制。

1 材料

1.1 动物SPF级雄性BALB／c小鼠，6～8周龄，体质量（20±2）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2017－0005，饲养于南京中医药大学实验动物中心，许可证号：SYXK（苏）2014－0001，温度22～26℃，湿度50%～60%，自由进食饮水。实验设计和操作经过南京中医药大学伦理委员会审批，伦理批号：ACU190902。

1.2 药物与试剂祛风宣肺汤（紫苏梗、炙麻黄、蝉蜕、半夏、佛耳草、白前、紫菀、百部、全蝎、南沙参、甘草，南京医科大学附属逸夫医院中药房）。HDM（美国Greer Laboratory公司，货号：XPB70D3A25）；免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）、白细胞介素－5（interleukin－5，IL－5）、IL－13 ELISA试剂盒（美国Invitrogen公司，货号分别为：88－7237－88、88－7054－88、88－7137－88）；兔抗鼠受体电位M8亚型通道蛋白（transient receptor potential melastatin 8，TRPM8）多克隆抗体（美国Novus生物公司，货号：NBPI－97311）。

1.3 仪器XSP－18B型光学显微镜（江南光电集团股份有限公司）；Syne－Rgy2型Biostack Ready酶标仪（美国Bio－Tek公司）；EG1150H型包埋仪（德国Leica公司）；Sorvall Legend Micro 17R型冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 药物的制备将祛风宣肺汤的中药饮片加水浸泡后，煎煮2次，每次1 h，混合并过滤两次药液，浓煎后加纯水定容至1.183 kg·L－1，4℃保存备用。

2.2 小鼠分组和模型建立将小鼠随机分为5组，即空白组、冷刺激组、HDM组、模型（冷刺激＋HDM）组、祛风宣肺汤（11.83 g·kg－1）组，每组8只；造模方法在传统方法［12］的基础上进行改进，HDM组、模型组和祛风宣肺汤组分别于第0天、第7天、第14天腹腔注射HDM（0.5 g·L－1）100μL，并于第21至第23天连续3 d滴鼻HDM（2.5 g·L－1）50μL。

将小鼠放入自制的低温箱内，即PP材料鼠笼（32 cm×21 cm×17 cm），撤除垫料，将笼深埋在碎冰中1 h，笼内温度低于10℃，笼内温度控制在（10±3）℃。第21至第23天，模型组和祛风宣肺汤组在滴鼻操作后与冷刺激组置于低温箱30 min。祛风宣肺汤组第0～24天每天给药1次，给药时间均在HDM处理前约30 min。每5天称小鼠的体质量，并调整剂量。

2.3 检测外周嗜酸性粒细胞（eosinophil，EOS）计数和血清免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）水平 最后一次滴鼻24 h后，麻醉小鼠，摘除眼球，收集血液，将20μL全血和380μL嗜酸性粒细胞计数液混匀滴于细胞计数板上，光镜下观察外周血EOS计数；剩余全血室温静置2 h，3 500 r·min－1离心15 min，取血清，用ELISA试剂盒检测血清IgE水平。

2.4 检测肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中的细胞因子小鼠脱颈处死，逐层分离颈胸部组织，暴露肺叶及颈部气管，结扎左侧肺叶，取1 mL的PBS灌洗右肺，收集BALF，4℃、1 000 r·min－1离心10 min，取上清液，－20℃保存。ELISA试剂盒检测BALF中IL－5和IL－13水平。

2.5 肺组织病理和免疫组织化学每组随机取3只小鼠，取左肺叶，保存于4%多聚甲醛中48 h，石蜡包埋、脱水、切片后进行HE染色和免疫组化分析。光镜下观察组织病理学改变，显微镜下观察靶蛋白的表达强度。根据染色程度进行半定量分析。以无染色计0，轻染计1，中染计2，强染计3，超强染计4［11］。分析操作由2名不参与本实验的专业病理人员完成。

2.6 统计学方法采用GraphPad Prism 8.0.2软件对数据进行统计分析，数据表示为平均数±标准误（±SEM），采用方差分析比较各组间的差异，Bonferroni检验进行秩后比较分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 观察小鼠的一般情况空白组、冷刺激组小鼠未出现明显异常的行为改变；HDM组、模型组小鼠激发前后出现甩头、抓耳、挠鼻、烦躁多动等行为变化；祛风宣肺汤组小鼠偶见有抓耳、甩头、挠鼻的动作。

3.2 检测BALF中IL－5、IL－13水平与空白组相比，冷刺激组和HDM组小鼠的BALF中IL－5、IL－13水平升高，模型组IL－5、IL－13的水平极显著升高（P＜0.000 1），以模型组复制效果最佳。与模型组比较，祛风宣肺汤组IL－5水平明显降低（P＜0.05），IL－13水平有降低趋势（P＞0.05）。见图1。

图1 支气管肺泡灌洗液IL－5、IL－13细胞因子水平

3.3 检测外周血EOS计数及IgE水平与空白组相比，冷刺激和HDM组小鼠的外周血EOS计数、血清IgE水平升高，模型组小鼠外周血EOS计数、血清IgE水平显著升高（P＜0.01），以模型组复制效果最佳。与模型组比较，祛风宣肺汤组小鼠外周血EOS计数、血清IgE水平均显著降低（P＜0.01）。见图2。

图2 血中嗜酸性粒细胞计数及IgE水平

3.4 观察肺组织病理形态学变化空白组、冷刺激组肺组织可见肺泡纹理清晰，肺泡间质少量炎性细胞浸润，气道上皮完整，纤毛结构清晰，肺组织形态基本正常；HDM组可见明显肺泡间质增宽，部分肺泡融合，气道黏膜增厚，纤毛脱落，气道周围及肺泡间质可见大量炎性细胞浸润；模型组肺泡间质及气管周围可见大量炎性细胞浸润增厚，部分肺泡融合，气道上皮脱落；祛风宣肺汤组的肺泡结构完整，纹理清晰，间质可见少量炎性细胞浸润，黏膜不厚，或见部分纤毛有脱落，病变程度明显减轻。见图3。

3.5 肺组织TRPM8蛋白表达情况与空白组相比，冷刺激组和HDM组小鼠肺组织TRPM8表达有升高的趋势（P＞0.05），模型组小鼠肺组织TRPM8表达显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，祛风宣肺汤组小鼠TRPM8通道蛋白表达明显降低（P＜0.05）。见图4、图5。

图3 肺组织病理形态学变化（HE，×200）

图4 小鼠肺组织TRPM8蛋白表达情况（×200）

图5 免疫组化半定量分析结果

4 讨论

支气管哮喘是一种涉及多种细胞及细胞组分的慢性呼吸道炎症性疾病。一般认为，特异性炎症反应是哮喘的重要病理机制。约50%哮喘患者表现为Th2细胞因子分泌增多、外周血EOS增加、血液IgE水平增高的病理特征［13］。EOS细胞型哮喘［14－15］、Th2细胞因子增高型哮喘［2，16］均属于此类。IL－5和IL－13是哮喘发生发展的重要细胞因子。CD4＋T细胞分化失衡，Th1／Th2细胞因子比例失调可导致IL－5、IL－13水平升高［17］，诱发哮喘或加重哮喘的症状。研究发现，除Th2细胞，2型固有淋巴细胞作为非T非B细胞亦是IL－5、IL－13的重要来源［18］，参与哮喘的特异性免疫的病理生理机制［17－18］。目前尚不可知两者在哮喘发生发展中各自所占有的比重，比较公认的是，气道上皮的上游事件［主要调节因子如胸腺基质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）、IL－25、IL－33等与相应受体结合］增加Th2型细胞因子的分泌，引起下游事件的级联反应，如特异性IgE水平升高，EOS、肥大细胞等炎性细胞增殖、局部募集与激活，最终导致气道重塑［2，17］。

TRPM8是瞬时受体电位离子通道蛋白（TRPs）的一员，是一种非选择性钙离子通道，可被低温（8～22℃）刺激或薄荷醇激活。研究表明，TRPM8表达于气道迷走神经、气道上皮细胞和肥大细胞胞膜表面［19－21］。冷刺激可通过激活TRPM8，刺激迷走神经传入纤维产生电冲动，引起由迷走神经支配的气道腺体黏液分泌增加、支气管平滑肌收缩等一系列气道反射活动，导致气道阻力增加［20］。冷刺激还可通过气道上皮细胞和肥大细胞上的TRPM8增加炎症因子（如IL－1β、IL－4、IL－6、IL－8、IL－10、IL－13、IL－25、IL－33、GM－CS、TNF－α）的分泌和组胺的释放而加重哮喘［21－22］。其中IL－1β可促进B细胞活化，激活Th2和Th17细胞参与哮喘和其他过敏性疾病的病理过程［23］。IL－6能促进急性反应蛋白的合成和IgE的转化，并协调IL－1的表达，刺激T细胞的增殖和分化［24］；部分难治性哮喘患者痰标本和BALF中可见IL－6和IL－8水平升高［25］。IL－25可促进2型免疫反应［26］；IL－25、IL－33能介导ILC2s分泌IL－4、IL－5、IL－13等Th2细胞因子，参与哮喘的病理机制。因此，TRPM8通路的开放可促进哮喘的发生发展，过表达TRPM8通道蛋白可增加炎症因子的分泌［27］，诱导炎症反应。相反，拮抗TRPM8通道蛋白可减少炎症因子分泌，或可缓解哮喘的症状。

祛风宣肺汤以苦温麻黄宣肺平喘，辛温紫苏叶祛风散邪，蝉蜕、全蝎止痉祛风，半夏、佛耳草化痰理肺，白前、紫菀、百部降气止咳，再佐以南沙参清肺养阴，以炙麻黄、半夏及紫苏梗之燥，甘草为使，调和诸药。诸药合用，共奏祛风解痉、理肺止咳之功效，临床上用于反复咳嗽、干咳少痰的咳嗽变异性哮喘颇有疗效。本研究发现，单独使用冷刺激或HDM干预均可刺激机体分泌IL－5、IL－13，导致EOS增殖，抗体表达增多，肺泡表面及气道上皮的TRPM8通道蛋白表达增加，联合冷刺激和HDM建模可显著放大此生物学效应，从病理机制上模拟了因气温变化而急性发作的哮喘模型，使用祛风宣肺汤后，小鼠的炎症指标明显降低，病理改变显著减轻，这初步解释了哮喘患者门诊量、住院率在换季时增加的现象及祛风宣肺汤的作用机理。结合文献研究和实验结果推测，祛风宣肺汤可通过抑制炎症因子的产生、下调TRPM8通道蛋白表达而缓解过敏性哮喘。而本实验缺少小鼠的肺功能等相应指标，缺少设立TRP通道拮抗剂作为对照组，其具体机制仍需进一步研究。